lncRNA VS骨形成

导语：骨是一个动态器官，通过破骨细胞和成骨细胞的协调产生自我修复潜力。衰老过程中骨的自我修复能力明显受损。间充质骨祖细胞（OPCs）向骨形成表面的迁移是成骨细胞生成的初始步骤，OPCs的迁移能力在衰老过程中是否受到损害，以及它如何促成衰老相关的骨形成减少仍不清楚。今天，lncRNA粉墨登场，演绎着不一样的精彩故事。

参考文献：Targeting long noncoding RNA PMIF facilitates osteoprogenitor cells migrating to bone formation surface to promote bone formation during aging （IF=8.579）

技术路线：

结果

1. 衰老过程中骨形成减少伴随OPCs向骨形成表面迁移减少，lnc-PMIF表达升高

收集衰老小鼠模型的骨标本，分析动态骨组织形态，发现老年小鼠的矿化沉积率(MAR)和骨形成率(BFR/BS)均显著降低，表明衰老期间小鼠的骨形成减少。从小鼠中分离出BMSCs，RNA-Seq分析发现老年BMSCs中迁移相关基因均下调。老年和年轻小鼠BMSCs成骨诱导7d后ALP活性和成骨诱导14d后钙矿物质沉积相当，表明BMSCs的成骨潜能在衰老过程中没有改变。再次从老年和年轻小鼠中分离BMSCs，Dil染色剂标记后体外增殖，胫骨内注射到另一批年轻小鼠中，三天后收获胫骨对成骨标志物Runx2进行荧光免疫染色。发现老年BMSCs处理的小鼠中Dil标记细胞降低，表明老化过程中OPCs向骨形成表面的迁移能力降低。大部分迁移到骨形成表面的Dil标记细胞表达Runx2，表明OPCs迁移到骨形成表面发生成骨分化，有助于体内骨形成。与年轻BMSCs相比，老年BMSCs的体外迁移能力明显受损，Macf1显著下调，从Macf1基因位点转录而来的长链非编码RNA PMIF（即lnc-PMIF）表达显著增高。上述提示，衰老过程中小鼠骨形成的减少伴随着OPCs向骨形成表面迁移的减少和OPCs中lnc-PMIF表达的升高。

2. Lnc-PMIF抑制OPCs迁移到骨形成表面

在成骨细胞分化过程中，lnc-PMIF在早期增加，在矿化启动后减少，表明lnc-PMIF可能在成骨分化的早期阶段发挥作用。过表达/敲低lnc-PMIF不影响OPCs的增殖和成骨分化。敲低lnc-PMIF的细胞迁移减弱，敲低组细胞处理的小鼠胫骨中Dil标记细胞数量升高，小鼠中lnc-PMIF表达更高。这些表明lnc-PMIF可抑制OPCs向骨形成表面的迁移，而不干扰其增殖和成骨潜能。

3.Lnc-PMIF与HuR相互作用抑制β-actin的表达以抑制OPC迁移

为探索Lnc-PMIF介导的OPC迁移的调节机制。RNA pull down-MS实验寻找lnc-PMIF的相互作用蛋白，鉴定出一种RNA结合蛋白HuR，WB证实HuR在生物素标记的lnc-PMIF细胞裂解的下拉组分中富集，RNA免疫沉淀(RIP)试验lnc-PMIF与HuR的结合。还检测到β-肌动蛋白显著升高，与免疫沉淀的HuR蛋白结合。接下来研究HuR-β-actin介导的调节机制是否参与OPC的迁移调节。β-actin的mRNA和蛋白表达以及细胞迁移能力在HuR基因过表达的细胞中显著增加， HuR基因敲低细胞中降低。β-肌动蛋白的mRNA和蛋白表达在lnc-PMIF过表达细胞中显著下调，但在lnc-PMIF基因敲除细胞中显著上调，表明lnc-PMIF能抑制OPCs中β-actin的表达，基因过表达/敲除lnc-PMIF不改变HuR的蛋白表达。在前述lnc-PMIF敲低细胞中敲低HuR基因，细胞中β-actin的mRNA和蛋白表达显著下调，细胞迁移能力也受到损害，这些数据表明lnc-PMIF可与HuR相互作用，抑制β-actin的表达来抑制OPC迁移。

4. lnc-PMIF与HuR的RRM3结合，中断HuR-β-actin mRNA相互作用，抑制β-actin表达，抑制OPC迁移

为阐明lnc-PMIF如何与HuR相互作用调节β-actin表达和OPC迁移，首先通过生物信息学分析预测了lnc-PMIF的二级结构，并合成生物素化的全长lnc-PMIF（WT）和截短的lnc-PMIF突变体，分别为突变体A1（无5’茎环的正义）、突变体A2（有中心茎环和3’茎环的正义）和突变体A3（仅有3’茎环的正义1100-1455 bp），转染MC3T3-E1细胞，并进行标记RNA链霉亲和素下拉试验。蛋白免疫印迹分析显示，HuR存在于转染WT lnc-PMIF、截短lnc-PMIF突变体A1或截短lnc-PMIF突变体A2的细胞的下拉部分中，但在转染截短lnc-PMIF突变体A3的细胞的下拉部分中不存在。这些数据表明，lnc-PMIF的中心茎环足以实现lnc-PMIF和HuR之间的相互作用。

接下来，我们合成了野生型HuR蛋白(WT)和HuR蛋白的截短突变体（即分别为单独HuR的RNA识别基序(RRM)1的突变体B1、单独HuR RRM2的突变体B2和单独HuR RRM3的突变体B3）（图4 C）。同时，我们设计并合成了生物素标记的或未标记的探针，分别特异性靶向lnc-PMIF的中心-茎环和生物素标记的或未标记的探针，特异性靶向之前报道的与HuR蛋白相互作用的β-actin mRNA的序列。RNA电泳迁移率变动分析(EMSA)发现只有当生物素标记的lnc-PMIF探针与WT HuR或截短突变体B3共孵育时，才能检测到lnc-PMIF-HuR复合物，这表明HuR的RRM3可介导HuR和lnc-PMIF之间的相互作用。lnc-PMIF与β-actin mRNA竞争与HuR相互作用。过表达HuR-RRM3后细胞中β-actin的mRNA和蛋白表达下降显著上调，迁移活性增强。所有这些表明lnc-PMIF可与HuR的RRM3结合，中断HuR-β-actin的相互作用，抑制β-actin的表达，抑制OPC的迁移。

5. 沉默lnc-PMIF促进老年OPCs向骨形成表面迁移，促进老年小鼠骨形成

BMSCs中沉默lnc-PMIF，增殖无变化，OPCs成骨能力不改变，细胞迁移数量高，表明沉默lnc-PMIF可增强老年OPCs的迁移能力，而不干扰老年OPCs的体外增殖和成骨分化。接受si-PMIF处理的老年BMSCs的小鼠中骨形成表面Dil +细胞数显著升高，提示沉默lnc-PMIF可促进老年OPCs在体内向骨形成表面迁移，大部分迁移的Dil +细胞中检测到Runx2表达，表明si-PMIF处理的老年BMSCs迁移到骨形成表面发生正常的成骨分化，这将有助于小鼠的骨形成。接受si-PMIF处理的老年BMSCs小鼠骨表面TGF-β+细胞的平均积分光密度显著更高，而TRAP+面积无显著差异，表明si-PMIF处理的老化BMSCs可能影响细胞募集，而不是骨吸收。上述si-PMIF或si-NC处理的老年BMSCs对老年雄性小鼠进行胫骨内注射，4周后接受si-PMIF处理的老年BMSCs的小鼠骨量更高，胫骨干骺端微结构更好，BMD和BV/TV更高，MAR和BFR/BS更高。这些结果证明，老年BMSCs敲低lnc-PMIF可促进骨形成。

6. 靶向递送lnc-PMIF siRNA接近骨形成表面的OPCs促进老年小鼠骨形成

接下来评价lnc-PMIF在骨形成表面周围的老年OPCs中系统靶向沉默对衰老相关骨质疏松的影响。为促进lnc-PMIF siRNA（即si-PMIF）接近骨形成表面周围的OPCs，si-PMIF或si-NC被包裹在骨形成表面靶向递送系统（即，(DSS6)-脂质体）。21月龄自然衰老的雄性和雌性小鼠静脉注射 (DSS6)-脂质体-si-PMIF、(DSS6)-脂质体-si-NC或(DSS6)-脂质体单药（溶剂）。si-PMIF处理组Gli1 +细胞中lnc-PMIF的表达显著降低，si-PMIF处理组两种性别小鼠的骨量更高，胫骨干骺端微结构更好，BMD和BV/TV更高，MAR和BFR/BS较高。这些发现表明，靶向沉默骨形成表面周围OPCs中的lnc-PMIF可以促进衰老相关骨质疏松小鼠的骨形成。