IFN暴露诱导的CD8 + T细胞线粒体异常加速系统性红斑狼疮病发
系统性红斑狼疮(SLE)患者大多数存在I型IFN刺激基因(ISGs)的高表达。线粒体异常也有报道，但I型IFN暴露对这些变化的贡献尚不清楚。此外，I型IFN通过上调脂肪酸氧化(FAO)和氧化磷酸化(OXPHOS)促进浆细胞样树突状细胞（pDCs）的线粒体功能。本文数据表明，I型IFN暴露通过代谢重编程促进CD8 + T细胞死亡，有助于SLE发病。本文于2021年3月发表在《Nature Communications》IF:12.121。
技术路线如下：
主要实验结果如下：
1、ISGs高表达患者OXPHOS基因下调
为了确定是否T细胞的转录组特征可以帮助鉴定SLE患者的疾病活动，作者对来源于激活和未激活女性的CD8+ T和CD4+ T细胞的mRNA进行测序。对DEGs进行聚类热图分析，发现SLE患者根据ISG表达水平被分为显著的两类：SLE-1和SLE-2（Fig. 1a, b）。在两种T细胞中，SLE-2类群的患者具有更强烈的I型IFN特征。在CD4+ T细胞中，这种特征伴随着参与JAK-STAT信号和T细胞共刺激的基因，而在CD8+ T细胞中，ISG基因的高表达与基因参与细胞周期，响应DNA损伤和凋亡有关（Fig. 1a, b）。比较SLE-1和SLE-2组的转录表达谱，结果显示，除ISGs外，mtDNA编码的OXPHOS基因的表达差异最大（Fig. 1c, d）。总之，SLE患者纯化T细胞的转录组学分析根据ISG表达水平将其分为两组，表达高I型IFN标记的患者显示线粒体编码基因和线粒体相关代谢途径的表达减少，在CD8 + T细胞中更明显。这表明SLE中与I型IFN相关的线粒体功能失调。
图1健康志愿者和SLE患者CD8+ T和CD4+ T细胞的转录组学分析
2、ISGs高表达患者CD8+ T细胞线粒体异常
在研究I型IFN信号与线粒体异常之间的潜在联系之前，应用计算机模拟和体外相结合的方法，根据I型IFN信号的强弱程度对SLE患者进行分层：高水平的ISGs(IFN-high)、低水平的ISGs(IFN-low)和无ISGs(IFN-Neg)。随后，探究IFN-high和IFN-Neg的SLE患者中T细胞的线粒体基因型，以类风湿性关节炎（RA）患者为疾病对照。结果发现，与健康组，IFN-Neg组和RA组相比，来源于IFN-high的SLE患者的CD8+ T细胞表现出线粒体大小增加（图2a,b）和线粒体膜超极化（图2c）。在IFN-High的SLE患者中，也观察到细胞ROS (cROS)阳性CD8+ T细胞比例增加，但只是线粒体ROS (mROS)染色细胞比例有上升趋势（图2d）。在IFN -Neg的SLE患者中也检测到更高比例cROS阳性细胞，这表明了一种疾病特异性效应（图2d）。
显微图像补充了流式细胞术数据，显示在来IFN-High的SLE的CD8+ T细胞中，线粒体在形态上与IFN -Neg的SLE患者不同，在IFN-High CD8+ T细胞中，每个细胞的平均线粒体总体积更大(图2e)。综上所述，这些数据表明，在SLE患者中，长期暴露IFNα可能会触发CD8+细胞的线粒体变化，但不会触发CD4+和T细胞的线粒体变化，这可能导致代谢紊乱的细胞，对其功能具有潜在的影响。
3、来自IFN-High的SLE患者的CD8+ T细胞的SRC减少
接下来比较了从SLE患者和HC外周血分选的离体CD4 + 和CD8 + T细胞的线粒体呼吸和有氧糖酵解。使用Seahorse细胞外通量分析仪，发现IFN-Neg患者的CD8 + T细胞具有与HC相似的基础和最大耗氧量率(OCR)，而IFN-High患者的CD8 + T细胞表现出较少的基础和最大OCR（图3a）。重要的是，在IFN-High CD8 + T细胞中，备用呼吸能力(SRC)，反映细胞适应能量需求增加的能力，显著降低（图3a）。SRC的降低伴随着细胞内ATP水平的一些降低（附图9a）。另一方面，从相同患者中同时分离的CD4 + T细胞中未检测到OCR或SRC的显著异常（图3a）。接下来探索在IFN-High患者的CD8 + T细胞离体观察到的代谢异常是否会导致T细胞缺陷。与健康对照和IFN-Neg SLE患者相比，IFN-High SLE患者的CD8 + T细胞自发死亡增加（图3b）。总的来说，数据表明，I型IFN通路的持续激活可能会降低CD8 + T细胞的代谢适合性，从而降低其存活能力。
图3 SLE患者CD8+T细胞的代谢分析和凋亡率
4、TCR和IFN信号共同诱导CD8+ T细胞代谢重组
为了研究导致IFN-High CD8 + T细胞线粒体和代谢变化的连续事件，接下来使用来源于健康对照和结合了延长IFN处理和TCR活化（这是SLE患者中存在的两种基本细胞信号）的细胞。尽管CD8 + T细胞暴露于IFNα 里2天不会引发任何显著的线粒体或代谢变化但7天IFNα暴露，尤其是结合T细胞活化，可诱导mtDNA编码基因表达下调（图4a）和线粒体变化（图4b）。然后，分析了CD8 + T细胞的氧化能力，发现在有或没有CD3/CD28活化的情况下，7天IFNα刺激显著增强了基础OCR，但没有最大OCR，当数值标准化到每个样本的基础水平时，导致SRC降低，尤其是当IFNα暴露与T细胞活化结合时（图4c）。
IFNα和抗CD3/CD28磁珠长期刺激后CD8 + T细胞中SRC能力的降低表明生物能量适应性受损。研究发现，IFNα刺激的CD8 + T细胞在初始爆发后，与仅用CD3/CD28刺激的CD8 + T细胞相比，其氧化和糖酵解能力下降更快（图4d）。总之，使用健康对照CD8 + T细胞的体外研究表明，虽然单独延长IFNα处理能够触发可检测的代谢改变，但只有IFNα暴露和T细胞活化的联合才能表型复制IFN-High SLE患者CD8 + T细胞中观察到的线粒体和代谢异常。
图4. 7天内IFNα暴露和T细胞活化引发的代谢变化
5、IFNα暴露诱导慢性激活CD8+ T细胞死亡
在建立重现SLE CD8 + T细胞代谢变化的实验条件后，接下来研究了下游效应。与SLE患者的离体数据一致，发现IFNα暴露延长联合T细胞活化可促进CD8 + T细胞的自发死亡（图5a）。与自发性细胞死亡数据一致，作者发现再激发后，暴露于IFNα的细胞中表达Annexin V的增殖性CD8 + T细胞百分比显著增加（图5b）。此外，在IFN刺激的细胞中检测到较少的脱颗粒（CD107a阳性）和活化的（CD69和CD25阳性）CD8 + T细胞（图5c）。总之，数据表明，I型IFN改变了SLE患者CD8+ T细胞的代谢，导致TCR再激发后细胞存活率降低。
图5. IFNα暴露7天诱导T细胞活化的变化
6、IFNα暴露增加CD8+ T细胞的NAD+的消耗
为了了解慢性I型IFN与CD8 + T细胞下游线粒体和代谢变化之间的机制联系，首先在SLE患者CD8 + T细胞的转录组学数据中探索了哪些通路与I型IFN信号相关。结果显示烟酸/烟酰胺代谢途径显示出最高的相关性（图6a），并且在IFN-high SLE患者的CD8 + T细胞中，NAD消耗酶，如ADP-核糖聚合酶（PARP9、PARP10和PARP12）和CD3828显著上调（图6b）。观察到延长IFNα和TCR刺激后CD8+T细胞中NAD +/NADH比值显著降低（图6d），该实验条件模拟了在IFN-high的SLE患者CD8 + T细胞中观察到的线粒体和代谢异常，表明在活化的CD8 + T细胞中，I型IFN信号引起的NAD消耗酶表达上调可导致NAD + 耗竭和随后的线粒体功能障碍。
为了检测补充NAD + 是否可以纠正IFNα刺激的下游效应，用1 mM β-烟酰胺单核苷酸(NMN)培养CD8 + T细胞以恢复NAD +/NADH比值（图6e）。然后，评估了用抗CD3/CD28再刺激后的氧化反应和细胞活力。补充NMN的NAD + 增加了OCR（图6f），但未增加ECAR，表明线粒体能力增加。重要的是，通过NMN处理恢复NAD + 的可用性改善了IFNα延长和TCR刺激后的细胞活力（图6 g），表明NAD途径调节这些活化的人CD8 + T细胞中的线粒体适应性和细胞存活率。总之，这些数据表明，在人TCR刺激的CD8 + T细胞中，延长IFNα暴露增加了NAD + 的消耗，并降低了NAD +/NADH比值。这导致再刺激后线粒体呼吸缺陷和细胞活力降低。NAD + 前体NMN纠正了这些代谢变化，提高了CD8 + T细胞活力。
图6. IFNα增加NAD+消耗导致SCR降低和细胞活力
本文在一组临床定义明确的SLE伴活检证实的肾炎患者中进行的T细胞转录组学和代谢研究表明，高IFN信号可驱动CD8 + T细胞线粒体代谢途径的变化，使其生物能量不适应且更容易死亡。本文证明在SLE患者的CD8 + T细胞中观察到的代谢重编程是延长IFNα暴露和TCR刺激的结果。在这两种刺激的持续组合下，这可能是SLE患者特有的一种情况，CD8 + T细胞表现出与NAD + 消耗增强、线粒体氧化能力降低和存活率下降相关的PARP基因表达增加（图7)。总的来说，本文的发现证明高ISG特征与SLE CD8 + T细胞的代谢适合性之间的联系，以及它们在压力下或对抗原再激发的反应中存活的能力。
图7. I型干扰素调节SLE患者CD8+T细胞的代谢适合度
参考文献：
Buang Norzawani., Tapeng Lunnathaya., Gray Victor., Sardini Alessandro., Whilding Chad., Lightstone Liz., Cairns Thomas D., Pickering Matthew C., Behmoaras Jacques., Ling Guang Sheng., Botto Marina.(2021). Type I interferons affect the metabolic fitness of CD8 T cells from patients with systemic lupus erythematosus. Nat Commun, 12(1), 1980. doi:10.1038/s41467-021-22312-y