低氧导致肝细胞癌进展的新连接体——CFL1蛋白

肝细胞癌(HCC)是全球第四大致命恶性肿瘤类型。然而，参与HCC进展的确切分子机制尚不清楚。本研究发现缺氧诱导的CFL1通过激活PLD1/AKT通路增加HCC的增殖、迁移、侵袭和EMT。本文于2021年3月发表在《Clinical and Translational Medicine》IF：7.919期刊上。

技术路线：

主要实验结果：

1、CFL1在HCC中高表达

门静脉瘤血栓(PVTT)是HCC预后不良的重要危险因素。取3对HCC和配对的PVTT组织进行iRTAQ检测，挖掘到946个差异表达蛋白。图1A列举了最显著上调的10个蛋白，其中CFL1在HCC中显著高表达。WB和免疫组化表明CFL1在癌旁组织，HCC和PVTT组织中表达逐渐上调（图1B-C）。随后在100对HCC和癌症组织，以及6株细胞系中检测了CFL1的表达，证实CFL1在HCC中高表达。

图1  PVTT、HCC及癌旁非肿瘤组织中CFL1的表达

2、CFL1的高表达与HCC的不良预后相关

单变量分析显示，肿瘤大小、肿瘤数量、TNM分期、静脉浸润、HBV感染和CFL1水平与HCC患者的总体生存率显著相关（表2）。多变量分析显示，仅肿瘤大小、肿瘤数量、静脉浸润和CFL1水平是HCC总体生存率的独立预后指标（表2）。并且，可以看出CFL1的高表达与HCC的不良预后相关。

3、CFL1促进HCC的增殖，迁移和侵袭

如图2所示，在高表达CFL1的HCCLM3和MHCC97h细胞中，敲除CFL1 (图2A)。随后实验发现敲除CFL1后HCCLM3和MHCC97h细胞的增殖，迁移和侵袭能力被抑制，表明CFL1促进HCC的增殖，迁移和侵袭。

图2 CFL1促进HCC的增殖和侵袭

4、CLF1敲除抑制小鼠HCC的生长和肺部转移

随后，作者在体内进一步验证CLF1的功能。结果如图3所以，敲除CFL1后显著降低了HCC细胞的肿瘤体积和肿瘤，并减少了肺转移结节数量。IHC表明CLF1的敲除也导致EMT相关蛋白的抑制。总之，CLF1敲除抑制小鼠HCC的生长和肺部转移。

图3 CLF1敲除抑制小鼠HCC的生长和肺部转移

5、CFL1是HIF-1α在HCC细胞中的下游靶基因

为了阐明低氧对HCC中CFL1表达的影响，将HCCLM3和Hep3B细胞在低氧培养箱中培养48 h。结果发现低氧诱导导致CFL1的表达升高，但是当HIF-1α敲除后，低氧诱导并不能提高CFL1的表达，并且使用HIF-1α的抑制剂处理HCCLM3和Hep3B细胞，也能降低因低氧诱导导致CFL1表达升高（图4A-F）。ChIP-PCR检测进一步发现，HIF-1α和HIF-1β与HCC细胞CFL1启动子中的HRE直接结合（图4G）。在低氧条件下，转染HRE荧光素酶质粒或CFL1启动子-荧光素酶质粒的HEK 293T细胞中荧光素酶报告基因活性升高（图4H）。

图4 HIF-1α激活HCC细胞中CFL1的转录

接下来，在低氧条件下，在HCCLM3和Hep3B细胞中敲低CFL1的表达（图5A）。结果表明，CFL1敲除显著逆转了缺氧诱导的HCCLM3细胞增殖、细胞迁移和侵袭以及EMT（图5A-D）。综上所述，这些结果表明CFL1表达受HIF-1α的转录调控，介导缺氧诱导的HCC进展。

图5 CFL1敲除逆转了HIF诱导的HCC细胞的增殖和侵袭

6、CFL1通过抑制泛素介导的PLD1降解来维持PLD1的表达

为了进一步探索CFL1在HCC中致癌作用的下游机制，利用KEGG数据库筛选了受CFL1影响的通路。其中CFL1的高表达与细胞膜中细胞粘附分子和蛋白的定位密切相关（图6A）。然后，基于蛋白质相互作用数据库预测了CFL1和PLD1之间的潜在相互作用（图6B）。CFL1敲低降低了HCCLM3细胞中PLD1的蛋白水平，而CFL1过表达增强了Hep3B细胞中PLD1蛋白表达（图6C）。co - IP实验表明，CFL1与PLD1相互作用，敲低CFL1可促进肝癌细胞中PLD1的泛素化(图6D-E)。用放线菌酮(CHX，2μg/mL)阻断肝癌细胞蛋白质合成。绘制蛋白降解曲线，表明CFL1敲低时PLD1蛋白降解更快（图6F）。此外，蛋白酶体抑制剂MG132(25 μM)处理可阻断CFL1敲低诱导的HCC细胞中PLD1降解（图6F）。因此，这些结果表明CFL1抑制肝癌细胞中泛素介导的PLD1蛋白水解。

图6 CFL1调节HCC细胞中PLD1的降解

7、CFL1/PLD1轴介导低氧诱导的HCC细胞中AKT途径的激活

之前的一项研究表明，PLD1激活AKT及其下游mTOR通路促进HCC细胞增殖、侵袭。与此一致，作者观察到CFL1敲除降低了p-AKT水平，在HCCLM3细胞中通过PLD1恢复增强了p-AKT水平（图7A，C）。此外，PLD1沉默逆转了CFL1诱导的Hep3B细胞中AKT信号转导通路的活化（图7B，D）。值得注意的是，CFL1或PLD1敲除抑制了肝癌细胞中缺氧诱导的AKT通路激活和EMT过程（图7E，F）。之后，进行拯救实验探讨HIF-1α-CFL1-PLD1轴中PLD1的功能。在HCCLM3细胞中过表达的PLD1可以逆转低氧条件下CFL1-shRNA引起的对AKT磷酸化或EMT过程的抑制（图7G，H）。总的来说，证实CFL1/PLD1轴在缺氧诱导的HCC进展中起重要作用。

图7 CFL1/PLD1轴介导低氧诱导的HCC细胞中AKT途径的激活

总之，该研究表明HCC中过表达CFL1与较差的临床病理学参数呈正相关。体外和体内实验证实CFL1是HCC肿瘤生长和转移的驱动因素。PDL1/AKT通路介导CFL1的致癌功能。此外，CFL1是一个缺氧反应基因，通过激活PLD1/AKT信号转导参与缺氧诱导的HCC进展（图8）。综上所述，该研究表明CFL1是低氧微环境与HCC进展之间的一种新的连接体。

图8本研究结果的示意图

参考文献：

Yao Bowen., Li Yazhao., Chen Tianxiang., Niu Yongshen., Wang Yufeng., Yang Yuanyuan., Wei Xinyu., Liu Qingguang., Tu Kangsheng.(2021). Hypoxia-induced cofilin 1 promotes hepatocellular carcinoma progression by regulating the PLD1/AKT pathway. Clin Transl Med, 11(3), e366. doi:10.1002/ctm2.366