治疗有望：间充质干细胞移植促进CD4+T细胞衰老改善红斑狼疮

人类人脐带来源的间充质干细胞（hUC-MSCs）移植被证实是治疗系统性红斑狼疮（SLE）的有效方法，但是详细的潜在机制仍不明确。转运miRNAs可能是MSCs交流其它细胞的方法。Sirt1是一种NAD依赖的去乙酰化酶，通过去乙酰化p53来防止细胞衰老。本研究旨在探讨在MRL/lpr狼疮小鼠模型中，hUC-MSCs是否通过miRNA调节Sirt1/p53来影响脾CD4+ T细胞的衰老。本文于2021年1月发表在《Theranostics》IF：8.597期刊上。

技术路线

主要实验结果

1、hUC-MSCs减轻缓解MRL/lpr小鼠的疾病进展

为了评估对MRL/lpr小鼠狼疮综合征的治疗作用，从17周龄开始用5 × 10⁵ hUC-MSCs或PBS治疗MRL/lpr小鼠，并在21周龄时处死所有小鼠(图1A)。与PBS处理的小鼠相比，hUC - MSC处理的小鼠的肾脏病变明显减少(图1B)。此外，与PBS处理的MRL/lpr小鼠相比，hUC-MSCs处理后小鼠的脾脏重量和蛋白尿明显降低 (图1C - D)。hUC - MSCs治疗组的血清anti-dsDNA抗体水平较低，但未达到统计学水平 (图1E)。数据表明hUC-MSCs改善MRL/lpr小鼠的狼疮疾病。

图1 hUC-MSCs减轻缓解MRL/lpr小鼠的疾病进展

2、hUC-MSCs增加MRL/lpr小鼠脾CD4+ T细胞的衰老通过Sirt1/p53信号

作者推测hUC-MSCs治疗MRL/lpr小鼠的潜在机制可能是通过增强CD4+ T细胞的衰老来抑制其积累。为了验证这一点，作者从脾细胞悬液中分离出单核细胞，然后纯化CD4+ T细胞用于RNA和蛋白质制备。测量了p21和p16水平作为早衰的标记物。结果显示与WT对照组相比，p21和p16的mRNA和蛋白质水平在MRL/lpr小鼠中显著降低，与此同时，与接受PBS处理的MRL/lpr小鼠相比， p21和p16的mRNA和蛋白表达在hUC-MSCs治疗组中显著增加 (图2A-C)。研究还发现，与WT小鼠相比，MRL/lpr脾脏CD4+ T细胞的Sirt1表达水平升高，在Lys-379位点的p53乙酰化水平降低，而hUC-MSCs治疗可以通过降低Sirt1水平、增加p53水平和p53乙酰化水平来逆转这一变化(图2C - E)。总之，上述结果提示，MRL/lpr小鼠脾脏CD4+ T细胞的衰老可能是有缺陷的由于Sirt1/p53的信号改变导致，这可能导致CD4+ T细胞的过度增殖。因此，hUC-MSCs的临床作用可能与脾CD4+ T细胞衰老通路的恢复有关。

图2 hUC-MSCs治疗使MRL/lpr小鼠脾CD4+ T细胞的衰老标记物在体内恢复正常

3、hUC-MSCs在体外增加MRL/lpr小鼠脾CD4+ T细胞的衰老通过Sirt1

在体内实验的同时，在体外测定了hUC-MSCs对T细胞衰老的影响。MRL/lpr小鼠脾CD4+ T细胞与hUC-MSCs以不同比例(CD4+ T细胞:MSCs: 1:1、10:1、50:1)共培养48 h。结果发现hUC-MSCs呈剂量依赖性方式显著上调p21和p16的水平，但下调Sirt1的水平 (图3A-C)。此外，细胞衰老的调节并不依赖于细胞与细胞之间的接触，用transwell系统分离培养的CD4+ T细胞和MSCs时也发现了类似的结果(图3D - F)。这些数据表明，可溶性因子介导了hUC-MSCs对MRL/lpr小鼠脾CD4+ T细胞衰老的调节作用。

图3 hUC-MSCs体外增加脾CD4+ T细胞衰老标志物

4、Sirt1是在MRL/lpr小鼠中hUC - MSCs介导的CD4+ T细胞衰老所必须的

接下来，检测了Sirt1是否是hUC-MSCs促进MRL/lpr脾CD4+ T细胞衰老所足够和必要的。研究发现，使用Sirt1抑制剂- EX527预处理MRL/lpr小鼠的CD4+ T细胞后，Sirt1的表达减弱，p21和p16的表达和p53的乙酰化水平均增加了 (图4A)。相反地，用Sirt1的选择性激活剂SRT1720预处理MRL/lpr小鼠的CD4+ T细胞后，可以抑制hUC-MSCs诱导的衰老(图4B)。综上所述，这些数据表明Sirt1是hUC-MSCs增加MRL/lpr小鼠脾CD4+ T细胞衰老的关键介质。

图4 Sirt1是hUC-MSCs增加MRL/lpr小鼠脾CD4+ T细胞衰老的中介物

5、hUC-MSCs调节MRL/lpr小鼠脾CD4+T细胞Sirt1/p53信号通过miR-199a-5p

文献报道在癌症和自身免疫疾病中，hUC-MSCs能够将miRNAs转移到周围的细胞。因此，作者考虑miRNAs是否可能参与hUC - MSCs介导的对脾CD4+ T细胞中Sirt1的表达调控。使用在线软件Target scan识别了10个miRNA，这些miRNA被预测靶向Sirt1。qPCR分析显示，在这10个miRNAs中，只有miR-199a-5p的表达在MRL/lpr脾CD4+ T细胞中显著降低(图5A)。此外，miR-199a-5p是hUC-MSCs处理后唯一表达增加的miRNA(图5A)。事实上，miR-199a-5p mimic不仅可以提高MRL/lpr脾CD4+ T细胞中miR-199a-5p的水平，降低Sirt1的表达(图5B-C)，而且还可以提高衰老标志物p21、p16和乙酰化p53的表达水平(图5D)。相反，miR-199a-5p抑制剂处理可提高WT小鼠脾CD4+ T细胞中Sirt1的表达(图5E)，并降低衰老标志物p21, p16和乙酰p53水平(图5F)。最后，与MRL/lpr相比，hUC-MSCs可增加miR-199a-5p的产生，表明hUC-MSCs是miR-199a-5p来源的关键调控因子 (图5G)。在transwell系统中，hUC-MSCs与MRL/lpr脾CD4+ T细胞共培养48 h后，细胞内miR-199a-5p升高，Sirt1基因表达降低，CD4+ T细胞中衰老标志物的表达水平恢复，而miR-199a-5p抑制剂处理后仍处于抑制状态(图5G-I)。总的来说，这些数据表明hUC-MSCs通过miR-199a-5p介导的Sirt1下调和随后p53去乙酰化的减少，增加了脾脏CD4+ T细胞的衰老。

图5 hUC-MSCs诱导的miR-199a-5p可增加MRL/lpr脾CD4+ T细胞衰老

6、MiR-199a-5p改善MRL/lpr小鼠疾病

接下来，在体内评估了miR-199a-5p对MRL/lpr小鼠的影响。17周龄MRL/lpr小鼠每4天注射20 nmol miR-199a-5p agomir或对照(agomir nc)，共4周(图6A)。末次注射后48 h处死小鼠，分离脾脏CD4+ T细胞。与对照组相比，miR-199a-5p agomir处理组显示miR-199a-5p水平升高(图6B)， Sirt1表达降低(图6C)，衰老标志物p21和p16的表达显著上调(图6D)。这些数据表明hUC-MSCs通过miR-199a-5p增加MRL/lpr脾CD4+ T细胞衰老。

图6 MiR-199a-5p agomir处理增加MRL/lpr脾CD4+ T细胞的衰老

接下来，研究系统给予miR-199a-5p agomir是否能挽救MRL/lpr小鼠的狼疮表型。与agomir nc组相比，miR-199a-5p agomir处理组脾脏和淋巴结明显缩小(图7A-B)，血清中anti-dsDNA抗体、IgG水平下降(图7D-E)。血清ANA水平有下降趋势(图7C)。miR-199a-5p agomir处理组的肾损伤，表现为尿蛋白下降（图7F），肾小球增大和细胞增生减少(图7G)，外周毛细血管袢中IgG沉积减少(图7h)。综上所述，这些数据表明hUC-MSCs移植通过miR -199a-5p介导的Sirt1信号下调从而增加脾CD4+ T细胞的衰老，改善MRL/lpr小鼠的疾病表型。

图7 MiR-199a-5p agomir治疗可改善MRL/lpr小鼠的疾病表型和免疫紊乱

参考文献：

Cheng Tao., Ding Shuai., Liu Shanshan., Li Yan., Sun Lingyun.(2021). Human umbilical cord-derived mesenchymal stem cell therapy ameliorates lupus through increasing CD4+ T cell senescence via MiR-199a-5p/Sirt1/p53 axis. Theranostics, 11(2), 893-905. doi:10.7150/thno.48080