桦树皮的新潜能：白桦素改善高脂血症和胰岛素抵抗以及动脉粥样硬化
固醇调控元件结合蛋白(SREBPs)是激活高脂血症特征性胆固醇、脂肪酸和甘油三酯生物合成的主要转录因子。本研究中发现了一种小分子，白桦素，它通过诱导SREBP裂解激活蛋白(SCAP) 与Insig相互作用特异性地抑制SREBP的成熟，进而降低胆固醇和脂肪酸的生物合成，改善饮食诱导的肥胖，降低血清和组织中的脂质含量，提高胰岛素敏感性，减小动脉粥样硬化斑块的大小。桦树皮中含有丰富的白桦素，有望成为开发治疗高脂血症药物的先导化合物。本研究于2021年1月发表在《Cell Metabolism》IF:21.567期刊上。
技术路线：
主要实验结果：
1、白桦素作为SREBP加工特异性抑制剂的鉴定
构建了一个由含SRE启动子驱动的荧光素酶报告基因，并从人肝癌细胞系Huh-7中生成了稳定表达该报告基因的细胞系(命名为Huh-7/SRE-Luc)。然后将该细胞与不同化合物孵育，并进行荧光素酶活性测定。有趣的是，只有白桦素[lup-20(29)-ene-3b, 28-diol]有效降低了荧光素酶的活性。白桦素是一种天然存在的五环三萜，可以很容易地从桦树皮中提取出来(最高可达干重的30%)。
作者直接检测了白桦素对SREBP加工的影响和特异性，并与25-HC进行比较。25-HC有三个主要作用：通过抑制SREBP-2的切割降低n-SREBP-2(图1A)；激活LXR，进而上调SREBP-1的转录，导致n-SREBP-1的增加(图1A)；促进HMG-CoA还原酶(HMGCR)的降解，HMGCR是胆固醇生物合成中的限速酶(图1B)。另一方面，白桦素有效降低了内源性的n-SREBP-1和n-SREBP-2(图1A)，表明白桦素在不激活LXR的情况下抑制了SREBP的加工。同时，白桦素并没有促进HMGCR的降解(图1B)。同样，白桦素以Insig依赖的方式完全阻止了转染SREBP-2的裂解(图1C)。因此，白桦素特异性地抑制了SREBP的加工，但并不激活LXR或加速HMGCR的降解。此外，在共免疫沉淀实验中，白桦素刺激了SCAP和Insig-1之间的相互作用(图1D, lanes 4和lanes 5)，这暗示白桦素的作用机制。
图1白桦素特异性抑制SREBP过程
为了进一步测试白桦素是否通过与SCAP结合发挥作用，合成了一种白桦素衍生探针，命名为化合物1(图2A)。化合物1包含一个光敏反应基和一个叠氮乙酰基，可以通过点击化学与生物素炔烃连接。与白桦素类似，化合物1可以抑制SREBP-2的加工(图2B)。化合物1与胆固醇敲除的CHO细胞的膜组分孵育，然后暴露在紫外线下激活交联。紫外线照射后，用click化学方法粘贴生物素标签。然后将膜球均质化，与亲和素结合的琼脂糖孵育，以拉下白桦素结合蛋白。如图2C所示，在化合物1和3 mM处，SCAP被沉淀，高浓度的白桦素可以取代其结合，说明白桦素与SCAP发生物理作用。作为阴性对照，用化合物1几乎不沉淀转铁蛋白受体，白桦素竞争没有影响(图2C)。总之，这些结果表明SCAP可能与白桦素结合，并且是其靶标。
图2白桦素作为SREBP加工特异性抑制剂的鉴定
2、白桦素下调SREBP靶基因，降低细胞脂质水平
由于SREBP-2是其自身的直接靶标，因此白桦素将其表达下调40％（图3A）。 与SREBP-2是胆固醇生物合成的主要转录因子这一观点一致，胆固醇合成途径中的10个被测基因，例如HMGCR，HMG-CoA合酶（HMGCS）和角鲨烯环氧酶（SE），都被白桦素处理抑制了（图3A）。 类似地，与脂肪酸和甘油三酸酯合成有关的所有9个基因，例如SREBP-1c，脂肪酸合酶（FAS）和乙酰辅酶A羧化酶α（ACC），都被白桦素显着下调（图3B）。 与早期观察结果一致（图1A），包括ABCG5和ABCG8在内的LXR靶基因不受白桦素的影响（图3C）。
与基因表达改变一致，白桦素处理以浓度依赖性的方式显著减少了胆固醇和脂肪酸的从头合成（图3D-E）。此外，白桦素降低了细胞胆固醇（图3F）和中性脂质（主要是胆固醇酯和甘油三酸酯）的稳态水平（图3G）。 两者合计，我们的数据表明白桦素抑制SREBP加工并下调胆固醇和脂肪酸的生物合成，从而降低细胞脂质水平。 有趣的是，洛伐他汀显着降低了胆固醇的合成（图3D），但也适度地增加了脂肪酸的生物合成（图3E），这可能是因为洛伐他汀是HMGCR的抑制剂，它可以阻断胆固醇的合成，进而刺激SREBP的活化，从而增加脂肪酸合成。
图3白桦素抑制胆固醇和脂肪酸的生物合成通过降低SREBP的靶基因
接下来，研究了白桦素在体内的作用。洛伐他汀是一种HMGCR抑制剂，具有良好的有益作用，将其与白桦素进行比较。用对照（盐水），洛伐他汀（30 mg/kg/day）或白桦素（15或30 mg/kg/day）处理西式饮食（WD）的C57BL / 6J小鼠6周。在治疗期间，未观察到白桦素或洛伐他汀的明显毒性，并且不同组的小鼠显示出相似的食物摄入（图4A）。有趣的是，尽管小鼠以30 mg/kg/day加WD饮食喂养的老鼠比chow饮食喂养的小鼠重，但它们的体重增加比WD喂养的老鼠少，这表明在此剂量下，白桦素和洛伐他汀可以预防饮食引起的肥胖症（DIO）（图4B）。洛伐他汀对体重的影响与以前的报道一致。
为了了解白桦素和他汀类药物的抗DIO作用，进一步分析了脂质吸收，体力活动和能量消耗。在洛伐他汀治疗的小鼠中，尽管呼吸商（RQ）增强，表明从体内利用葡萄糖和蛋白质进行能量生产已超过脂质氧化，但耗氧量和总能量消耗仍与WD喂养的小鼠相似（图4F-4H）。另一方面，用洛伐他汀喂养的小鼠的粪便胆固醇和甘油三酸酯（TG）显着增加（图4C和4D），表明洛伐他汀降低脂质吸收或增加脂质排泄，从而拮抗DIO。这一观察结果与以前的报告是一致的。另一方面，白桦素对脂质吸收/排泄没有影响（图4C和4D）。尽管每组小鼠的身体活动都相似（图4E），但接受白桦素的小鼠的RQ升高（图4F），其耗氧量和能量消耗也增加了（图4G和4H），这可能有助于他们体重增加量的减少。同时，接受30 mg / kg /day白桦素的小鼠暴露于寒冷时显示出更高的体温（图4I）。进一步的Q-PCR分析显示，在经白桦素处理的小鼠中，棕色脂肪细胞组织（BAT）中的两个关键生热基因UCP-1和UCP-2升高（图4J）。该观察结果与关于UCP-1在n-SREBP-1c转基因小鼠的BAT中显着降低的报道是一致的。总之，这些数据表明，洛伐他汀可能通过减少脂质吸收/增加排泄来至少部分地预防DIO，而白桦素通过增加能量消耗来改善DIO。
图4白桦素对小鼠体重，粪便脂质和能量消耗的影响
测量了血液和其他组织中的脂质水平，如图5所示。洛伐他汀和白桦素处理的小鼠的血清总胆固醇（TC）和甘油三酸酯（TG）的水平显着低于对照治疗的小鼠（图5A和5B）。值得注意的是，与洛伐他汀相似，白桦素降低了LDL胆固醇（LDL-c）的含量并增加了HDL胆固醇（HDL-c）（图5C和5D）。 有趣的是，尽管白桦素和洛伐他汀均降低了肝脏的TC水平，但只有白桦素显着降低了肝脏的TG含量（图5E和5F）。
组织学分析表明，白桦素可以减少白色脂肪细胞组织（WAT）和棕色脂肪细胞组织（BAT）的细胞大小，而洛伐他汀仅可以减少棕色脂肪细胞的大小（图5G）。 油红色O切片染色表明，与用WD喂养的对照治疗小鼠的肝脏相比，洛伐他汀或白桦素处理的小鼠的肝脏具有较低的脂质蓄积（图5G）。这与洛伐他汀和白桦素降低肝脂质含量的先前数据一致（图5E和5F）。
图5 白桦素对血液和组织中的脂质水平的影响
由于白桦素可降低血清和组织中的脂质水平，因此接下来研究了白桦素是否可改善体内胰岛素抵抗。与进食chow粮的小鼠相比，由WD喂养的小鼠表现出葡萄糖受损和胰岛素耐受性。WD喂养的小鼠的白桦素或洛伐他汀治疗可显着改善葡萄糖耐量和胰岛素抵抗（图6A-6D）。 此外，WD喂养的小鼠的空腹血糖和胰岛素升高通过白桦素的施用而被显着降低，但洛伐他汀却没有（图6E和6F）。总体而言，这些数据表明，白桦素可改善小鼠的胰岛素抵抗。
图6 白桦素对饮食诱导的小鼠葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗的影响
6、白桦素降低动脉粥样硬化的发展
用LDLR敲除小鼠探索了白桦素对动脉粥样硬化病变形成的作用。LDLR缺陷小鼠用WD饮食并分别添加了成分，对照（盐），洛伐他汀（30 mg/kg/day）或白桦素（30 mg/kg/day）处理14周。不同组的小鼠显示出相似的食物摄入量和体重（图7A-7B）。在经白桦素处理的小鼠肝脏中，SREBP-1c和SREBP-2降低，脂质合成基因（包括HMGCS，HMGCR和FAS）下调（图7C）。但是，洛伐他汀可上调HMGCR和FAS基因的表达（图7C）。白桦素极显着降低了血液中的TC，TG和LDL-c的含量，并增加了HDL-c（图7D-7G）。洛伐他汀具有类似的作用，只是它不降低TG（图7D–7G）。与对照处理的小鼠相比，洛伐他汀或白桦素处理的小鼠的主动脉斑块的数量和大小显着降低（图7H和7I）。特别是，主动脉弓（图7J）和胸主动脉（图7K）的病变区域明显较小。以上数据表明，白桦素降低了WD喂养的LDLR敲除小鼠动脉粥样硬化病变的形成，并稳定了主动脉根部粥样硬化斑块。
图7 胰岛素处理减轻LDLR-/-小鼠的动脉粥样硬化
总之，本文确定了SREBP的一种特定的小分子抑制剂，即betulin白桦素，可以降低脂质水平，增强胰岛素敏感性并减少动脉粥样硬化斑块的形成。 这些数据支持以下观点：抑制SREBP途径可能是治疗II型糖尿病和动脉粥样硬化的有用策略。 Betulin可以作为药物控制代谢性疾病的主要化合物。
参考文献：
Tang JJ, Li JG, Qi W, et al, 2021. Inhibition of SREBP by a Small Molecule, Betulin,
Improves Hyperlipidemia and Insulin Resistance and Reduces Atherosclerotic Plaques. Cell Metabolism. 13:44-56. DOI: 10.1016/j.cmet.2010.12.004