神经元中FTH的敲除抵消了褪黑素对创伤性脑损伤铁死亡的保护作用
创伤性脑损伤（TBI）是重要的健康问题，每年有超过5000万新发TBI病例。在TBI的病理生理过程中，会发生各种形式的细胞死亡，包括细胞凋亡，坏死，程序性坏死，自噬，焦亡和铁死亡。目前尚未充分挖掘TBI中铁死亡的发病机理。今天我们讲一篇苏州大学团队在JOURNAL OF PINEAL RESEARCH（IF=14.526）期刊发表的题名为Deletion of ferritin H in neurons counteracts the protective effect of melatonin against traumatic brain injury-induced ferroptosis的文献。该文献主要讲述褪黑素通过FTH调节TBI中铁死亡。
1. 褪黑素可减轻TBI引起的铁死亡
为了确定褪黑素是否可以挽救TBI引起的铁死亡，在相应的高峰表达（例如1天和3天）进行了与铁死亡相关蛋白的蛋白质印迹分析。发现褪黑素给药在TBI后1天抑制了TBI诱导的xCT，Cox2，Tfr1，Fpn和Nox2蛋白表达的上调。同样，褪黑素治疗在TBI后3天阻止了Fth，Ftl和4HNE蛋白的表达。用促铁蛋白抑制剂liproxstatin-1（Lip-1）也获得了相似的结果。此外，免疫组化染色显示，与对照组相比在TBI后第7天，褪黑素和Lip-1的处理减少了神经元中4HNE阳性细胞的数量，表明褪黑素对TBI诱导的脂质具有神经保护作用过氧化。褪黑素和Lip-1均抑制TBI诱导的皮质GSH水平降低。褪黑素和Lip-1抑制TBI诱导3天后损伤皮层中MDA含量的上调。这些数据表明，TBI导致了与铁死亡相关蛋白表达的时间变化，以及同侧皮层中某些受推定的铁死亡生物标志物的变化，但是用褪黑素有效地挽救了TBI诱导的铁死亡。
2. 褪黑素可挽救TBI后皮层的铁蓄积和神经元损伤
为了进一步研究褪黑素在TBI后铁蓄积和神经元损伤中的假定作用，在TBI后第3天，在受伤的皮层中观察到了Fe2 +，Fe3+，总铁含量显着增加。而褪黑素或Lip-1抑制TBI诱导的血清和同侧皮层中铁含量的上调的。Perls的蓝色染色表明，TBI后第7天铁阳性细胞的数量显着增加，褪黑素或Lip-1治疗组的铁阳性细胞少于对照组。鉴于TBI诱导的铁超载伴随着Fth表达的上调，使用免疫荧光染色观察了TBI后神经元中Fth的表达。发现与假手术组相比，模型组中Fth阳性神经元的显著增加，而褪黑素和Lip-1处理显着降低了Fth阳性神经元。与假手术组相比，受伤的神经元的细胞体在TBI后7天出现胞质萎缩或核固缩。褪黑素和Lip-1处理可减轻这些组织病理学变化。TBI后第7天， FJB染色测定脑部神经元变性，发现TBI导致大脑皮层变性神经元的数量增加，但是褪黑素和Lip-1给药明显减少了变性神经元的数量。这些数据表明褪黑素可防止TBI诱导的铁蓄积并防止同侧皮质的神经元损伤。
3. MT2受体可能参与褪黑素对TBI引起的铁死亡的保护作用
为了阐明褪黑素的保护TBI作用是否依赖于褪黑素受体，首先确定了TBI后褪黑素受体（MT1和MT2）的表达模式。从12小时到14天观察到皮质MT1和MT2表达显着降低。此外，褪黑素可在24小时显着改善褪黑素治疗的TBI小鼠大脑中MT1和MT2的损失。为了确定褪黑素的受体是否参与褪黑素对TBI引起的铁死亡的保护作用，当用Luzindole（褪黑素受体拮抗剂）或4P-PDOT（一种选择性MT2受体拮抗剂）预处理小鼠时，我们发现用Luzindole和4P-PDOT进行的预处理均消除了TBI后24小时褪黑素对MT1和Cox2表达的影响。值得注意的是，用4P-PDOT预处理消除了褪黑素对MT2表达和GSH含量的修复作用，以及褪黑素对xCT和4HNE的影响。本研究的数据表明，MT2受体是主要的褪黑素受体亚型，可能参与了褪黑素对TBI引起的铁死亡的保护作用。
4. 褪黑素可减少TBI诱发的小鼠脑行为缺陷和病变体积
为了利用褪黑素对TBI诱导的神经系统结果和病变体积的影响，进行了行为分析以及HE染色。关于线握测试，与假手术组相比，TBI在第1-8天导致运动表现显着下降，但与TBI组相比，褪黑素和Lip-1的治疗改善了第2-6天的运动表现。在MWM测试中观察到，与假手术组相比，TBI在第10-15天导致潜伏期延长，但是褪黑素和Lip-1治疗的TBI小鼠均表现出比TBI小鼠明显更短的逃避潜伏期。旷场试验中，与假手术组相比，TBI组的动物的总距离、中心移动距离和花费时间明显缩短。褪黑素治疗可显着逆转上述参。HE染色显示，褪黑素和Lip-1治疗的TBI组在TBI后第16天的病变体积明显小于TBI组。两者合计，结果提供了褪黑素治疗小鼠中TBI后改善运动，记忆和焦虑结局以及病变体积的证据。
5. 在基础条件下，Fth -KO小鼠皮层中铁稳态轻度受损
使用蛋白质印迹分析，实时PCR和Fth免疫荧光证实了在基础条件下神经元Fth表达的丧失。Fth- KO小鼠的FTH mRNA和蛋白表达较低。我们还通过免疫荧光观察了Fth的神经元水平。从他莫昔芬处理的皮层神经元Fth- KO小鼠具有减少的免疫原性FTH的。重要的是，在神经元中观察到几乎罕见FTH阳性细胞Fth- KO小鼠。有趣的是，神经元中Fth的丧失并未导致Ftl表达的代偿性增加。接下来，检查了神经元Fth在铁代谢和氧化还原稳态中的假定作用。Fth-KO组与对照组相比，皮质Fe2 +，Fe3+，总铁水平显著增加。Perls的蓝色染色显示在生理条件下，在Fth- KO中观察到的铁阳性细胞相对较少。这些结果表明，Fth- KO小鼠具有活力和繁殖力，但铁代谢发生了改变，这提供了神经元铁蛋白的铁存储功能在维持皮质铁稳态基础条件中起重要作用的证据。
6. Fth -KO小鼠易患TBI引起的铁死亡
为了进一步研究神经元Fth在TBI诱导的铁死亡中的作用，首先研究了神经元Fth在TBI诱导的皮质铁超负荷中的作用。与对照小鼠相比，Fth- KO小鼠在TBI后受损皮层和血清中出现了更严重的铁过载。Fth- KO小鼠的皮质非血红素铁水平更高，并且Fth- KO小鼠Tfr1表达没有明显变化，而Fpn表达却明显降低。然后，在Fth- KO小鼠皮质的SLC7A11 mRNA显著增加和PTGS2 mRNA无显著变化。WB分析显示XCT的显著增加。th-KO小鼠在第1天之后TBI在降低皮质GSH水平F，相对于对照小鼠。发现TBI后3天，Fth-KO小鼠的皮质MDA水平显着增加。此外， TBI后Fth-KO小鼠受损皮层中4HNE阳性细胞数量增加，表明脂质过氧化水平增加；在TBI后受伤侧的KO小鼠中FJB阳性神经元的数量显着增加，表明Fth缺乏导致TBI后神经元损伤加重。综上所述，这些结果表明，由于Fth- KO小鼠对铁蓄积的敏感性增加，因此更容易受TBI诱导的铁死亡的影响，这提供了神经元Fth丧失导致TBI诱导的铁死亡的证据。
7. 在Fth- KO小鼠中， TBI后褪黑素对神经的保护作用被大大取消
为了进一步探索神经元Fth的丧失是否影响褪黑素对TBI诱导的铁死亡的影响，测量了铁死亡的几种假定的生物标志物。发现治疗KO小鼠上皮层非血红素铁的水平没有影响。令人惊讶的是，尽管褪黑素治疗的和未治疗的Fth -KO小鼠的Tfr1 mRNA和蛋白表达水平没有显着差异，但是在褪黑素治疗的小鼠中，观察到Fpn mRNA和蛋白表达水平显着增加Fth- KO小鼠。值得注意的是，与未治疗的Fth- KO小鼠相比，用褪黑素治疗Fth- KO小鼠未能显着改变mRNA（Slc7a11，Ptgs2）和蛋白质（xCT，Cox2、4HNE）的表达。另外，用褪黑素治疗Fth- KO小鼠并没有统计学上降低GSH和MDA以及4HNE的水平，和FJB阳性细胞的数目。这些结果表明褪黑素没有统计学上减少TBI引起的铁死亡和神经元变性。
8. 褪黑素不能挽救Fth 敲低HT-22细胞中机械性损伤引起的铁死亡
为了进一步证实褪黑素对Tth小鼠在Fth- KO小鼠中的上述作用，将HT-22细胞系用siRNA转染，然后在体外进行机械刮擦损伤。siRNA敲低Fth可以降低Fth的蛋白质水平。鉴于脂质过氧化是铁死亡的标志，使用DCF和BODIRY 581/591 C11作为评估了溶质ROS。与对照组+刮擦损伤组相比，siFth +刮擦损伤组细胞的荧光强度显着增加，表明siFth增强了HT-22细胞中机械刮擦损伤引起的ROS产生的上调。重要的是，与未经治疗的siFth组相比，用褪黑素处理siFth转染的HT-22细胞未能显着减少刮擦损伤后ROS的上调。另外，相对于对照组，在生理条件下，单独使用siFth不能显着增加ROS的产生。对铁死亡的抗性与抑制BODIRY-C11氧化有关。与上述ROS结果一致。测量了铁死亡的几种推定生物标志物，包括xCT，Cox2和4HNE表达。如预期的那样，与对照组+刮擦损伤组相比，在siFth转染的HT-22细胞中，刮擦损伤的xCT表达显着下降，而Cox-2和4HNE的表达显着增加。重要的是，与未经治疗的siFth组相比，用褪黑素处理siFth转染的HT-22细胞在刮伤后未能显着改变xCT，Cox2和4HNE的表达。另外，在生理条件下，单独的siFth与对照组之间上述蛋白质的表达没有显着差异。这些结果表明，用siFth转染的HT-22细胞易受机械性刮擦损伤诱导的脂质过氧化和铁死亡的影响，而褪黑素在统计学上并未减轻损伤后的铁死亡，并且siFth不会影响褪黑素受体的表达。
