高转移肝细胞癌外泌体S100A4通过激活STAT3促进肿瘤转移
细胞间的相互作用在肿瘤进展和转移中发挥关键作用。目前关于这些肿瘤细胞是如何与其他细胞相互交流的仍有很多是未知的。肿瘤释放的外泌体被认为是肿瘤进行细胞间沟通的有效介质。Dong等探索了肝细胞癌（HCC）外泌体在其转移和预后价值中的功能。本文于2021年6月发表在《Signal Transduction and Targeted Therapy》期刊上，IF：13.493。
技术路线：
主要实验结果：
1、外泌体的分离与鉴定以及HCC细胞的释放和吸收
使用投射电子显微镜观察了外泌体的形态和形状；纳米粒子跟踪分析发现外泌体直径在40-200nm之间，并且在6个HCC细胞系外泌体中都检测到了外泌体标志物CD63，CD9，和Alix的表达；然后使用DIO标记高转移性HCC细胞的外泌体（HMH-exo）和低转移性HCC细胞外泌体（LMH-exo），在激光扫描共焦显微镜下观察到绿色标记的HMH-exo和LMH-exo都可以被低转移性HCC细胞细胞系有效吸收（图1）。这些结果表明已经成功分离和纯化HCC来源的外泌体并且他们可以被其它HCC细胞吸收。
图1外泌体的分离与鉴定以及HCC细胞的释放和吸收
为了探究HCC转移时外泌体在细胞与细胞串扰中的可能作用，作者实验HMH-exo预处理低转移性的HCC细胞系。结果发现，与LMH-exo或者PBS预处理组相比，HMH-exo显著增强了低转移性HCC细胞系的转移能力；随后作者使用低转移性HCC细胞系构建了体内原位异种移植瘤模型，成瘤后使用外泌体治疗6周，最后检测肝脏肿瘤和肺转移，结果显示与其它组相比，HMH-exo组的肝脏肿瘤更大，肺转移结节更多。（图2）。这些结果表明HMH-exo可以在体内外增强低转移性HCC细胞的转移能力。
图2 HMH-exo增强低转移性HCC细胞系的转移潜力
3、外泌体S100A4是HCC细胞转移潜力的关键增强子
为了探究通过HMH-exo增强HCC转移能力的关键，作者对LMH-exo和HMH-exo进行了iTRAQ质谱筛选。结果从HMH-exo中鉴定到116个显著上调和43显著下调的蛋白质；结果发现了4个蛋白家族的聚类：Apo、PSM、EEF/EIF和S100钙结合蛋白家族（图3a-b）。经过文献分析，作者主要关注了S100钙结合蛋白家族，并以其中最显著差异表达的4个蛋白为主：依次是S100A4，S100A6，S100A10，和 S100A11。作者检测了这4个蛋白在5个HCC细胞系外泌体中的表达丰度，结果发现依然是S100A4的表达水平最高（图3c）。因此，初步选择S100A4进行下一步分析。
进一步检测S100A4的功能，结果显示敲除S100A4显著降低高转移性HCC细胞系的迁移和侵袭能力，过表达S100A4则显著增强低转移性HCC细胞系的迁移和侵袭能力（图3d）。然后作者收集了S100A4敲除和S100A4过表达的HCC细胞的外泌体，结果得到了类似的结论，S100A4过表达外泌体显著增强HCC细胞的迁移和侵袭，以及体内肺部转移的能力（图3e-f）。这些结果证实了外泌体S100A4具有增强HCC细胞转移潜力的功能。
图3外泌体S100A4是HCC细胞转移潜力的关键增强子
4、外泌体S100A4通过STAT3磷酸化激活OPN转录
接下来探究了S100A4的作用机制，首先选择了21个肿瘤干性相关基因，然后下载了GEO数据进行相关性分析，结果显示S100A4主要和11个基因正相关（图4a）。随后检测了不同HCC细胞系中敲除和过表达S100A4后11个基因的表达水平的改变，结果显示只有OPN是S100A4的下游基因，其表达受到S100A4的调控（图4b-f）。OPN是促进HCC转移和干性的关键因子，但外泌体S100A4调节OPN的机制仍不清楚。
图4 S100A4的表达与OPN正相关
有趣的是，研究报道S100A4可以增强STAT3的磷酸化，而STAT3的磷酸化与OPN的表达是相关的，并且STAT3被预测是OPN的潜在转录因子。因此，检测了S100A4敲除和过表达后OPN表达，STAT3表达和STAT3磷酸化，结果显示OPN表达和STAT3磷酸化水平与S100A4的变化趋势一致；并且敲除STAT3后HCC细胞系中OPN表达和STAT3磷酸化被显著抑制（图5a-c）。这些结果表明S100A4可以激活STAT3磷酸化并增加OPN表达。
为了进一步探究S100A4过表达外泌体对STAT3磷酸化和OPN表达的影响，使用该外泌体预处理HCC细胞，结果显示它可以显著促进 STAT3磷酸化和OPN表达，以及S100A4的表达（图5d）。此外，在原位异种移植瘤模型中，HMH-exo显著增强了核STAT3磷酸化和细胞质OPN的表达（图5e-f）。总之，以上结果表明S100A4过表达外泌体促进低转移性HCC细胞的转移潜力，而外泌体S100A4是HCC细胞的关键增强子，其通过激活STAT3的磷酸化和上调OPN的表达实现其功能（图6a）。
图5 外泌体S100A4通过STAT3磷酸化激活OPN转录
5、血浆外泌体S100A4和OPN水平联合可以作为HCC患者术后的强力预后因子
在168例接受肝切除术的HCC患者中，进一步研究了血浆外泌体S100A4和OPN水平的临床意义。结果发现外泌体S100A4水平和OPN的表达显著正相关，并且外泌体S100A4低表达组患者的总体生存率和无疾病生存率要显著高于外泌体S100A4高表达组（图6b-d）。随后，基于外泌体S100A4水平和OPN水平的联合分析，将患者分为4组，结果发现双低水平S100A4和OPN组具有最好的预后，而双高组则预后最差（图6e-f）。
图6血浆外泌体S100A4和OPN水平联合可作为HCC患者术后的强力预后因子
参考文献：
Sun Haoting., Wang Chaoqun., Hu Beiyuan., Gao Xiaomei., Zou Tiantian., Luo Qin., Chen Mo., Fu Yan., Sheng Yuanyuan., Zhang Kaili., Zheng Yan., Ren Xudong., Yan Shican., Geng Yan., Yang Luyu., Dong Qiongzhu., Qin Lunxiu.(2021). Exosomal S100A4 derived from highly metastatic hepatocellular carcinoma cells promotes metastasis by activating STAT3. Signal Transduct Target Ther, 6(1), 187. doi:10.1038/s41392-021-00579-3