Caspase-11介导的肝细胞焦亡促进非酒精性脂肪性肝炎的进展

    非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是一种结果严重的炎症性疾病。肝细胞死亡，包括凋亡、坏死和焦亡，在NASH的病理生理学中已被证实。到目前为止，Caspase-11在NASH中的确切作用仍不清楚。本文详细介绍了2021年4月发表于“Cell Mol Gastroenterol Hepatol”（IF=7.706）的文章“Caspase-11–Mediated Hepatocytic Pyroptosis Promotes the Progression of Nonalcoholic Steatohepatitis”。本研究探讨了Caspase-11在NASH中的潜在作用。NASH小鼠肝脏中Caspase-11表达上调。MCD处理的Caspase-11缺乏的小鼠肝损伤、纤维化和炎症减轻。MCD治疗后Caspase-11缺乏小鼠Gasdermin D和IL-1β的激活被抑制。过表达Caspase-11促进脂肪性肝炎。

技术路线

结果

1.        肝脂肪变性小鼠肝脏中Caspase-11表达上调和激活

为了探讨Caspase-11在肝脂肪变性中的作用，我们首先检测了肝脂肪变性小鼠肝脏中Caspase-11的表达。如图1A所示，与正常小鼠相比，MCD诱导的肝脂肪变性小鼠肝脏中Caspase-11 mRNA明显增加。相应的，在MCD诱导的肝脂肪变性小鼠的肝脏中，pro-caspase-11(图1B和C)和cleaved-caspase-11(图1B和D)的蛋白水平均显著上调。这些结果提示Caspase-11与肝脏脂肪变性呈正相关。

2.        Caspase-11 缺乏减弱MCD诱导的小鼠肝脂肪变性

为了评估Caspase-11对肝脂肪变性的潜在影响，我们在Caspase-11缺陷小鼠中诱导肝脂肪变性并监测表型。正常野生型和Caspase-11缺陷小鼠肝脏组织学表现正常。野生型小鼠经MCD治疗后，肝脏出现明显的脂肪变性和肿胀。与MCD处理的野生型小鼠相比，MCD处理的Caspase-11缺陷小鼠的脂肪变性和肿胀明显减少(图2A)。相应的，与MCD处理的野生型小鼠相比，MCD处理Caspase-11缺陷小鼠肝脏脂肪变性评分(图2B)和膨胀评分(图2C)显著降低。我们进一步发现，MCD处理的Caspase-11缺陷小鼠显示更低的血清谷丙转氨酶(ALT)水平(图2D)、血清天冬氨酸转氨酶(AST)水平(图2E)和肝脏甘油三酯水平(图2F)。总之，我们的结果表明Caspase-11缺陷减轻了MCD诱导的小鼠肝脏脂肪变性。

3.        Caspase-11缺乏减弱NASH小鼠的肝纤维化

 通过测量纤维化相关因子的表达我们评估Caspase-11缺失对MCD诱导的肝纤维化的影响。在正常条件下，野生型和Caspase-11缺陷小鼠的TGF-β(图3A)、α-Sma(图3B)和Col1a1(图3C)表达相似。MCD处理的野生型小鼠中TGF-β、α-Sma和Col1a1的表达显著上调。相比之下，MCD处理的Caspase-11缺陷小鼠TGF-β、α-Sma和Col1a1的mRNA水平显著降低。这些结果表明，Caspase-11缺乏可减少MCD处理小鼠的肝纤维化。

4.        Caspase-11缺失抑制MCD诱导的肝脏炎症

接下来，我们评估了Caspase-11缺乏对MCD诱导炎症的影响。首先，我们比较了野生型和Caspase-11缺陷小鼠肝脏白细胞浸润情况。在正常情况下，野生型小鼠和caspase-11缺陷小鼠肝脏中CD45细胞的比例相似(图4A和B)。MCD治疗导致野生型小鼠肝脏中CD45细胞的比例增加。相比之下，MCD治疗仅轻微增加了Caspase11缺陷小鼠肝脏中CD45细胞的比例。与MCD处理的野生型小鼠相比，MCD处理的Caspase-11缺陷小鼠肝脏中CD45细胞的比例明显下降(图4A和B)，表明MCD处理后Caspase-11缺陷导致肝脏中白细胞浸润减少。相应地，我们发现了MCD治疗促进肝脏F4/80的表达而Caspase-11缺乏则抑制MCD诱导的F4/80上调(图4C)。我们进一步发现MCD治疗诱导野生型小鼠肝脏中TNF-α(图4D)、IL-1β(图4E)和CCL2(图4F)的表达。相比之下，与MCD处理的野生型小鼠相比，MCD处理的Caspase-11缺陷小鼠肝脏中TNF-α(图4D)、IL-1β(图4E)和CCL2(图4F)蛋白水平显著降低。这些结果表明Caspase-11缺陷抑制了MCD诱导的肝脏炎症。

5.        Caspase-11缺乏抑制小鼠肝细胞焦亡

我们评估了Caspase-11缺乏对MCD处理后小鼠焦亡活化的影响。我们检测了Gsdmd和IL-1β的激活，这是焦亡的两个关键因素。我们在未处理的野生型和Caspase-11缺陷小鼠肝脏中检测到类似的Gsdmd(图5A和B)、Gsdmd-N(图5A和C)和pro-IL-1β(图5A和D)蛋白水平。此外，我们在野生型和Caspase-11缺陷小鼠的肝脏中均未检测到成熟的IL-1β蛋白(图5 A和E)。MCD处理诱导了野生型小鼠肝脏中pro-Gsdmd(图5A和B)、Gsdmd-N(图5A和C)、pro-IL-1β(图5A和D)和成熟IL-β(图5A和E)的表达，表明MCD诱导了Gsdmd和IL-1β的激活。相比之下，与MCD处理的野生型相比，MCD处理的Caspase-11缺陷小鼠肝脏中pro-Gsdmd(图5A和B)、Gsdmd-N(图5A和C)、pro-IL-1β(图5A和D)和成熟IL-β(图5A和E)的蛋白水平显著降低。野生型小鼠和Caspase11缺陷小鼠肝脏中pro-caspase-1(图5A和F)和cleaved caspase-1(图5A和G)的蛋白水平相似。在野生型小鼠和Caspase-11缺陷小鼠中，MCD处理显著降低了pro-caspase 1的蛋白水平(图5A和F)，而增加了活性Caspase-1的蛋白水平(图5A和G)。此外，Caspase-11缺陷小鼠的活性caspase-1水平明显低于野生型小鼠，说明MCD处理Caspase-11缺陷小鼠肝脏中Caspase-1的激活较少。同样，我们在MCD处理的Caspase-11缺陷小鼠的肝细胞中检测到较少的Gsdmd-N表达(图5H和I)。这些结果表明，Caspase-11缺失减弱了MCD诱导的Gsdmd和IL-1β的激活。

6.        Caspase-11缺乏抑制脂多糖诱导的肝细胞焦亡和体外损伤

我们在体外评价Caspase-11缺乏对肝细胞焦亡的影响。我们用脂多糖(LPS)处理野生型小鼠原代肝细胞，发现LPS诱导了pro-caspase-11和caspase-11的表达(图6A和B)，表明LPS诱导了原代肝细胞中caspase-11的激活。我们进一步处理来自野生型和Caspase-11缺陷小鼠的原代肝细胞，并监测Gsdmd的表达和激活。如图6C和D所示，LPS处理未在野生型和Caspase-11缺陷的原代肝细胞中诱导pro-Gsdmd的表达。我们检测到LPS处理的野生型小鼠原代肝细胞中Gsdmd-N明显增加。相比之下，LPS处理不影响Caspase-11缺陷小鼠原代肝细胞的Gsdmd-N水平，且Gsdmd-N水平显著低于野生型小鼠原代肝细胞。此外，LPS诱导野生型原代肝细胞中IL-1β(图6E)、ALT(图6F)和AST(图6G)的表达。相反，在Caspase11缺陷的原发性肝细胞中，LPS诱导的IL-1β(图6E)、ALT(图6F)和AST(图6G)的产生显著减少。综上所述，Caspase-11的缺失抑制了LPS诱导的Caspase-11和GSDMD的体外激活。

7.        抑制NF-kB可抑制LPS和MCD诱导的Caspase-11表达

NF-kB已被证明在Caspase-11的表达和NASH发展中起重要作用。为了检测NF-kB是否参与LPS和MCD诱导的Caspase-11表达，我们在LPS处理的原代肝细胞和MCD处理的小鼠中使用NF-kB抑制剂JSH-23。如图7A所示，LPS处理促进了Caspase-11 mRNA的表达，而JSH-23则抑制了LPS诱导的caspase-11的上调。相应的，我们检测到LPS处理的原代肝细胞中pro-caspase-11蛋白水平显著升高，而JSH-23/LPS处理的原代肝细胞中pro-caspase-11蛋白水平显著降低(图7B和C)。MCD处理诱导野生型小鼠肝脏中Caspase-11 mRNA(图7D)和蛋白(图7E和F)的表达。相比之下，JSH-23治疗可抑制MCD诱导的Caspase-11的表达。

8.        过表达Caspase-11加重MCD诱导的小鼠肝脂肪变性

由于缺乏Caspase-11减弱MCD诱导的肝脂肪变性，我们检测肝脏中Caspase-11过表达对MCD诱导的肝脂肪变性的影响。我们在Alb-Cre小鼠肝细胞中过表达Caspase-11(图8A)。正常情况下，对照组和过表达Caspase11的小鼠肝脏组织学形态正常。MCD处理导致对照和过表达Caspase11的小鼠肝脏出现明显的脂质积聚(空泡)。此外，过表达caspase-11的小鼠肝脏中的空泡比对照小鼠肝脏中的大且多(图8B)。相应的，与MCD处理的对照组相比，过表达Caspase-11的小鼠脂肪变性评分(图8C)和膨胀评分(图8D)显著升高。类似地，与对照组小鼠相比，MCD处理的caspase-11过表达的的小鼠血清中ALT(图8E)、AST(图8F)和肝脏甘油三酯(图8G)升高。为了进一步确定过表达的Caspase-11是否足以加重MCD诱导的NASH，我们给小鼠使用了Caspase-1抑制剂belnacasan。belnacasan治疗显著降低MCD治疗对照组小鼠的脂肪变性评分(图8H)。相比之下，belnacasan治疗不影响MCD处理的Caspase-11过表达小鼠的脂肪变性评分。同样，belnacasan处理显著降低了MCD处理对照组小鼠的肿胀评分(图8I)、血清ALT(图8J)、AST(图8K)和肝脏甘油三酯(图8L)，而MCD处理过表达Caspase-11小鼠的这些指标没有明显影响。综上所述，过表达Caspase-11足以促进MCD诱导的小鼠脂肪性肝炎的严重程度。

结论

MCD处理后Caspase-11缺陷小鼠的肝损伤、纤维化和炎症明显减轻。Caspase-11缺失可改善NASH患者的肝细胞焦亡。