肿瘤抑制因子DRD2-乳腺癌治疗靶点

 乳腺癌(BrCa)是世界范围内最常见的癌症，诊断为IV期患者的5年相对生存率有所下降。晚期BrCa被认为是不可治愈的，目前仍缺乏有效的治疗策略。识别和表征新的肿瘤抑制基因对于建立有效的晚期BrCa预后生物标志物或治疗靶点非常重要。2021年3月发表于Theranostics（IF=11.556）的文献“Tumor suppressor DRD2 facilitates M1 macrophages and restricts NF-κB signaling to trigger pyroptosis in breast cancer”对此展开了研究。在本文中，在BrCa中，DRD2被发现由于启动子甲基化而下调。DRD2的高表达与更长的生存时间正相关，尤其是在HER2阳性患者中。DRD2还能促进BrCa细胞对紫杉醇的敏感性。DRD2异位表达显著抑制BrCa肿瘤发生。在体内和体外，DRD2也能诱导细胞凋亡和坏死。DRD2通过与β-arrestin2、DDX5和eEF1A2相互作用抑制NF-κB信号通路的激活。有趣的是，DRD2还调节微环境，促进巨噬细胞M1极化，并触发GSDME执行的焦亡。

技术路线

结果
1）DRD2通过启动子甲基化在转录上下调
    为了研究新的潜在TSGs，采用BrCa组织和正常组织进行RNA-seq筛选。与正常乳腺组织相比，BrCa组织中DRD2 mRNA表达明显下调(图1A)。免疫组化染色发现，与BrCa组织相比，正常乳腺组织中DRD2蛋白水平也较高(图1B)。同样，基于TCGA，在BrCa中也观察到DRD2 mRNA的下调，并且在BrCa中DRD2启动子甲基化也更频繁(图1C)。根据Kmplot，DRD2的高表达促进了BrCa患者的更长的生存期，这也在HER2阳性基因型患者中可见。但这一优势在Luminal A患者中未见(图1D)。根据RT-PCR和MSP结果，几乎所有的BrCa细胞系与永冻的正常乳腺细胞系相比，都可以看到DRD2 mRNA表达下调或缺失以及启动子甲基化(图1E)。因此，DRD2的高甲基化频率可能有助于其下调BrCa。Aza药物去甲基化恢复了两种沉默的BrCa细胞系MDA-MB231和BT549中DRD2的表达(图1F)。

2）在体内和体外，DRD2的表达抑制BrCa细胞的肿瘤发生

构建过表达DRD2的MDA-MB231和BT549细胞，通过RT-PCR (Figure 2A)和WB (Figure 2B)验证。CCK8实验证明，DRD2异位表达抑制肿瘤细胞生长(图2C)。在单层集落形成实验(图2D)和软琼脂形成实验(图2E)中，DRD2也损害了存活能力。并进行细胞凋亡和细胞周期分布分析。DRD2的表达显著促进了BrCa细胞凋亡(图2F)，并阻断了MDA-MB231和BT549在G2/M期的凋亡(图2G)。此外，过表达DRD2促进了BrCa细胞对PTX的敏感性(图2H)。在伤口愈合实验中，异位表达的DRD2比对照组表现出更少的闭合人工伤口的能力(图2I)。与此相一致的是，DRD2的过表达显著降低了BrCa的迁移和侵袭(图2J)。在体内进一步测定了DRD2的抑瘤作用。皮下肿瘤模型显示过表达DRD2模型的肿瘤体积和重量均减小(图2K)。

3）DRD2重新编码Mφ M1表型，下调IL-6和IL-10

据报道，DRD2可调节M1的极化。结果显示，在DRD2表达水平较高的BrCa组织中，M1 Mφ的浸润增加，M2 Mφ的浸润减少(图3A)。为进一步研究DRD2对TAMs的调控作用，构建了BrCa与Mφ共培养体系。当Mφ与表达DRD2的BrCa细胞共培养时，qRT-PCR显示M1表型标记增加，M2 Mφ标记下调(图3B-C)。qRT-PCR也证实了载体转染的BrCa细胞将Mφ调节为M2型(图3C)[12]。WB结果显示，表达DRD2的BrCa细胞上调M1标记iNOS，下调M2标记CD206(图3D)。IF染色显示，与表达DRD2的肿瘤细胞共培养后，Mφ表现为M1表型(图3E)。上述结果表明，BrCa中的DRD2具有将Mφ重新编码为M1表型的能力。

为了探索使Mφ向M1表型分化的关键调控因子，我们进行了细胞因子阵列分析。结果表明，TNF-α和两种诱导M1极化的经典细胞因子IFN γ均未增加。而与Mφ共培养后，DRD2显著下调IL-6和IL-10(图3F)。分析荧光值，进一步证实IL-6和IL-10下调(图3F)。因此，DRD2可以将Mφ重新编码为M1表型，并在crosstalk过程中显著下调IL-6和IL-10。

4）DRD2重编程的Mφ诱导肿瘤细胞的焦亡

如HE所示，来自小鼠模型的肿瘤承载DRD2显示肿瘤细胞死亡增加(图4A)。在免疫组化染色中，表达DRD2的4T1肿瘤样本中pMLKL表达较高(图4A)。根据TUNEL实验，DRD2也促进了体内细胞凋亡(图4B)。DRD2上调GSDME而不是GSDMD(图4C)。在crosstalk过程中，Mφ进一步促进了DRD2转染的BrCa细胞中GSDME的表达(图4C)。在表达DRD2的BrCa细胞中，Mφ也能上调IL-1β(图4C)。WB结果表明，DRD2诱导了MLKL的磷酸化，而在共培养过程中，MLKL被Mφ抑制(图4D)。此外，DRD2表达激活了caspase-8，而激活被Mφ抑制(图4D)。假设，DRD2可能在与Mφ crosstalk时诱发焦亡。BrCa细胞中与Mφ共培养时，NLRP3在表达DRD2的BrCa细胞中被触发。激活的caspase-1蛋白水解也能诱导IL-1β和IL-18的成熟(图4D)。在共培养过程中，Cleaved caspase-3表达上调(图4D)。此外，在共培养过程中发现表达DRD2的BrCa细胞中，GSDME的N端发生了剪切(图4D)。为了确定是否由M1 Mφ引起焦亡，我们使用了LPS诱导的M1 Mφ培养基，结果表明，在表达DRD2的BrCa细胞中，M1 Mφ仅触发NLRP3组装并剪切GSDME(图4E)。以上结果提示， M1 Mφ以DRD2依赖的方式触发BrCa细胞的焦亡。

5）DRD2通过阻断TAK1的磷酸化来限制NF-κB信号的激活

NF-κB信号的激活对于触发炎症小体组装和随后的焦亡是必不可少的。IF染色显示DRD2几乎阻断了p-p65的核易位(图5A)，但这种抑制被Mφ所抵消(图5B)。核和细胞质提取物也显示DRD2抑制了p-p65的核易位(图5C)。如WB结果所示，在LPS刺激下，DRD2抑制IKKα/β、IκBα和p65的磷酸化(图5D)。异位DRD2表达也显著抑制了Mφ诱导的p65磷酸化和IKKα/β的上游激活(图5E)。WB结果显示DRD2下调NF-κB的下游靶点ICAM-1。然而，这种下调被Mφ所抵消(图5E)。抑制IKKα/β磷酸化提示DRD2负向介导IKK复合物上游。TAK1在催化IKKα和IKKβ中起关键作用。TAK1的磷酸化被异位DRD2表达显著抑制(图5D-E)。因此，DRD2通过阻断上游激酶TAK1来抑制NF-κB信号通路的激活。

作为一种典型的G蛋白偶联受体， DRD2的内化诱导其受体β-arrestin2在质膜上的募集，并增加其与β-arrestin2的亲和力。LPS和CM刺激了DRD2和β-arrestin2的蛋白-蛋白结合(图5F-G)。同时，通过IF染色观察到，经过LPS处理后，DRD2似乎在细胞质中与p-p65结合(图5A)， Co-IP和IB进一步证实了这种结合(图5F)。据报道，β-arrestin2信号的激活会破坏星形胶质细胞中TAK1-Tab1的结合，而这种结合对于TAK1的激活至关重要。本研究还证实，内化的DRD2可以促进TAB1与β-arrestin2的结合，削弱TAB1与TAK1的结合(图5H)。综上所述，DRD2激活的β-arrestin2通过竞争性地结合TAB1来拮抗TAK1的磷酸化。

6）DRD2通过下调DDX5和eEF1A2来抑制NF-κB通路的激活和肿瘤的发生

DRD2异位表达显著抑制了p65和NF-κB靶基因IL-10的mRNA表达(图6A)，表明在没有配体激活的情况下，DRD2是NF-κB通路的负调控因子。除了结合激活β-arrestin2外，DRD2还可能通过其他方式抑制NF-κB信号通路。采用Co-IP法分离可能的结合蛋白，并采用质谱法进行蛋白鉴定。MDA-MB231和BT549细胞的所有结合蛋白中，DDX5、eEF1A2和ICAM-1均被异位表达的DRD2下调(图6B-C)。根据以往的研究，DDX5和eEF1A2是几种癌症中的两种致癌基因。WB也证实了DDX5和eEF1A2蛋白水平下调(图6D)。在293T和MDA-MB231中，通过Co-IP和IB实验证实了DRD2、DDX5和eEF1A2的结合(图6E)，表明这三种蛋白形成了一个复合物。根据以往的研究，DDX5可以结合p50，并协助IκB释放p50。本研究还揭示了293T和MDA-MB231中DDX5与p50的结合(图6E)。此外，有报道称DRD2可在神经系统中与EGFR结合。在BrCa细胞中，293T和MDA-MB231中也证实了DRD2和EGFR的结合(图6E)。DRD2的表达下调ERBB1 (EGFR)和ERBB2 (HER2)的表达(图6F)。在异位表达DRD2的BrCa细胞中，DDX5可以促进p-IκBα的磷酸化，增加磷酸化p65的蛋白水平(图6G)。eEF1A2可直接显著上调p-p65的表达，而不影响IKKα/β或IκBα，甚至在没有LPS的情况下，eEF1A2可上调表达DRD2的MDA-MB231的p-p65蛋白水平(图6G)。以上结果表明，DDX5和eEF1A2对NF-κB信号通路的促进作用受DRD2异位表达的抑制。

结论：这项研究新发现了一种肿瘤抑制基因-DRD2，可以提高BrCa患者的生存率和PTX治疗反应。DRD2诱导细胞凋亡和坏死，并在Mφ向M1重编程过程中进一步触发焦亡。DRD2通过与β-arrestin2结合，下调DDX5和eEF1A2，从而限制NF-κB信号通路的激活。DRD2是一种潜在的预测预后的生物标志物，并且DRD2是BrCa中一个很有前途的治疗靶点。