circACTN4与FUBP1相互作用通过调节原癌基因MYC的表达促进乳腺癌的发生和进展

乳腺癌是世界上女性发病率最高的恶性肿瘤。2018年全球新诊断乳腺癌约210万例，约占所有女性恶性肿瘤病例的25%。环状RNA（circRNA）是近年来在各种物种中广泛发现的一类新RNA。由于共价环结构，circRNA 对 RNA 核酸外切酶具有抗性，并且比线性 RNA 更稳定。今天我们讲一篇关于circRNA与乳腺癌的文章，题名为：The circACTN4 interacts with FUBP1 to promote tumorigenesis and progression of breast cancer by regulating the expression of proto-oncogene MYC。该文章发表在Molecular Cancer期刊上，IF=27.401。

USF2促进circACTN4在BC中的表达

为了研究 circRNA 在 BC发展中的功能，利用芯片分析检测了4对BC组织和癌旁组织中circRNA表达特征。共发现85个显著差异表达的circRNAs， 63 个上调和22个下调circRNAs。热图显示了14个上调的circRNA，其中circACTN4是失调最严重的一个，差异高达10倍。根据circBase数据库发现circACTN4来自位于人类19号染色体上的ACTN4基因，产生于ACTN4外显子2至外显子7（共571bp），通过 Sanger 测序验证了反向剪接连接点。为了验证circACTN4的环形结构，使用聚敛引物和发散引物扩增环状 circACTN4 和线性 ACTN4。通过FISH和核质分离PCR观察到circACTN4主要位于BC细胞的细胞核中， circACTN4在癌组织中的表达高于癌旁组织。，放线菌素D处理后的 qRT-PCR 和 RT-PCR 分析表明，circACTN4 在指定的时间点具有抗性。随后，生物信息学预测上游转录因子2(USF2)可能与ACTN4的启动子结合。因此，构建了携带全长野生型和突变型ACTN4启动子的荧光素酶报告基因载体，结果表明USF2增强了荧光素酶野生型荧光素酶报告基因的活性。Chip-qPCR检测进一步证明USF2可以与ACTN4基因启动子结合并增强其转录活性。设计并构建了USF2过表达和敲低质粒，通过qRT-PCR检测到转染相应质粒的BC细胞中ACTN4的表达。结果表明，上调的 USF2 显着增加了线性ACTN4和circACTN4的表达，而下调的USF2显着降低了线性ACTN4和circACTN4的水平。这些结果表明ACTN4是转录因子USF2的靶基因。

circACTN4 在 BC 组织和细胞中高度表达并与临床病理特征相关

为探讨circACTN4的表达及其临床意义，qRT-PCR检测80对BC组织及邻近非肿瘤组织中circACTN4的表达。circACTN4在BC组织中的表达显着高于配对的癌旁组织。qRT-PCR检测20对BC和癌旁组织中线性ACTN4的表达，数据显示线性ACTN4在BC组织中高表达。Pearson相关分析显示circACTN4的水平与BC组织中线性ACTN4的表达呈正相关。结果表明 circACTN4 和 ACTN4 的共过表达协同促进了乳腺癌的进展。RO曲线分析，circACTN4的AUC（曲线下面积）为0.719，诊断特异性和敏感性分别为70%和70。circACTN4 在 BC 细胞中的表达显着高于正常乳腺上皮细胞 MCF-10A。接下来，评估circACTN4的表达与临床病理特征的关联。circACTN4的表达与年龄（P  = 0.036）、T（P  = 0.001）、N（P  = 0.001）和TNM分期（P < 0.001）呈正相关，但与分级无关。利用ISH检测包含240个 BC组织的组织芯片确定circACTN4的表达。Kaplan-Meier生存分析显示，circACTN4高表达患者的总生存期比circACTN4低表达患者的总生存期短。circACTN4的表达与T分期、N分期和TNM分期呈正相关。Cox 比例风险模型评估 circACTN4 的预后价值。结果显示circACTN4的过表达是BC患者预后不良的独立预测因子（HR = 4.566，P <0.001）。circACTN4 可以发挥致癌作用，circACTN4 的高表达可以预测 BC 患者的不良预后。

circACTN4促进BC细胞增殖并调节细胞凋亡

为了探索 circACTN4 在 BC 细胞中的生物学功能，将circACTN4过表达质粒和circACTN4的siRNA转染到BC细胞中。qRT-PCR验证敲低过表达效率及不影响ACTN4线性转录本的表达水平。集落形成、EdU和CCK-8检测表明 circACTN4的过表达显着增强了BC细胞的增殖能力，而circACTN4的敲低显着抑制了细胞活力。hoechst 33342染色显示，转染si-circACTN4后，BC细胞出现明显的凋亡形态特征，包括荧光更强、核片段、染色质聚集和凋亡小体。使用AnnexinV/PI染色通过流式细胞术检测细胞凋亡率，结果表明circACTN4敲低可以诱导BC的细胞凋亡。WB结果显示，circACTN4 的下调导致更高水平的caspase-3和Bax以及更低的Bcl-2表达。

circACTN4 增加迁移和侵袭并调节 BC 细胞的细胞周期进程

为了进一步评估 circACTN4在BC进展中的作用，在 circACTN4 过表达或敲低后研究了 BC 细胞的迁移、侵袭和细胞周期。划痕和transwell试验表明，BC细胞的侵袭和迁移能力因 circACTN4 的上调而显着增加，但被 circACTN4 的下调显着抑制。WB结果发现过表达或敲低BC细胞中MMP9和MMP2蛋白水平明显升高或降低，nm23-H1表达明显降低或升高。式细胞术测定细胞周期分析，结果显示与对照组相比，circACTN4的敲低导致S期BC细胞比例较低，G1期BC细胞比例较高，这表明circACTN4沉默导致G1期阻滞BC 细胞。此外，WB显示BC 细胞中敲低 circACTN4 后，CDK4、CCNE1 和 CCND1 蛋白水平显着下调，这可能阻止了 BC 细胞的细胞周期进程。

CircACTN4 直接与 FUBP1 相互作用并激活 MYC 的转录

为了探索circACTN4的分子机制，首先进行了pull down和质谱分析circACTN4结合蛋白，发现FUBP1在circACTN4上显着富集。RIP 检测进一步证实 FUBP1 可以通过qRT-PCR与BC细胞中的内源性circACTN4 特异性结合。FISH-IF 分析显示 circACTN4和FUBP1共定位于细胞核中。但是circACTN4 的上调和敲低并没有改变 FUBP1的表达水平，表明circACTN4不参与FUBP1的翻译后调控。ChIP-PCR测定证实FUBP1与BC细胞中MYC启动子结合。构建了 FUBP1 和 FIR 过表达和敲低质粒。通过qRT-PCR和蛋白质印迹确定转染效率。qRT-PCR和WB的结果表明，FUBP1的上调或下调分别显着增加或降低了BC细胞中MYC的表达水平。此外， qRT-PCR发现FUBP1在BC组织中的表达明显高于邻近正常组织中的表达。Pearson相关分析表明circACTN4的水平与BC组织中FUBP1的表达呈正相关。此外，MYC在BC组织中高表达，并与 FUBP1的表达呈正相关。为了确认ACTN4在BC中的生物学功能，构建了ACTN4过表达和干扰质粒，为了探究 circACTN4 的作用与 ACTN4 无关，进行了共转染实验，结果表明 ACTN4 敲低不影响促进作用circACTN4 对 MYC 转录的过度表达，ACTN4 的上调并没有逆转 qRT-PCR 和蛋白质印迹对 circACTN4 敲低对 MYC 表达的抑制作用。WB结果表明circACTN4可以促进MYC及其下游蛋白CDK4和CCND2的表达。这些数据表明 circACTN4 可以与 FUBP1 结合并促进 MYC 的表达。

circACTN4 和 FIR 与 FUBP1 竞争结合

推测circACTN4可以与FUBP1竞争性结合并阻止FIR与FUBP1结合以促进 MYC的转录和表达。为了进一步验证提出的假设，qRT-PCR检测了BC和匹配组织中FIR的表达，与正常相邻组织相比，BC组织中FIR的表达显着下调。Pearson相关分析表明，FIR的表达与BC组织中circACTN4、FUBP1和MYC的水平呈负相关。免疫共沉淀试验结果表明，在过表达circACTN4的BC细胞的FUBP1-共免疫共沉淀物中未发现明显的FIR蛋白带，而在circACTN4被敲低后，通过蛋白质印迹在共免疫共沉淀物中明显检测到FIR，这表明上调的circACTN4显着削弱FIR与 FUBP1的结合，同时下调 circACTN4 显着加强了 FUBP1 和 FIR 之间的相互作用。ChIP分析结果表明，高浓度si-circ#2转染后FIR和FUSE的结合水平高于低浓度si-circ#2转染后FIR和FUSE的结合水平。此外，沉默 FIR 显着增强了 MYC 的表达，而过表达 FIR 通过 qRT-PCR 和 BC 细胞中的蛋白质印迹降低了 MYC 的水平。OE-FIR 或 sh-FIR 与 circACTN4 或 si-circ#2 共转染后，我们发现过表达 FIR 可以逆转 circACTN4 对 MYC 表达的增强作用，而 FIR 敲低可以抵消下调的抑制作用qRT-PCR 在 MYC 水平上检测到 circACTN4。总之，这些结果表明circACTN4可以抑制FIR和FUBP1的结合以减轻FIR的抑制作用，从而促进MYC转录。

FIR 逆转 circACTN4 在 BC 细胞中的肿瘤促进作用

为了进一步研究 circACTN4 是否通过 circACTN4/FUBP1/MYC 轴发挥其生物学作用，在 OE-FIR 或 sh-FIR 与circACTN4或si-circ#2 共转染后，在 BC 细胞中进行了一系列拯救实验。结果表明，FIR 过表达可以显着逆转 circACTN4 上调在 BC 细胞增殖、迁移和侵袭中的促进作用，而 FIR 敲低通过伤口愈合、EdU 和 transwell 测定减弱了 BC 细胞中 circACTN4 下调介导的抑制作用。此外，IF 分析还表明 FIR 过表达和敲低可以明显逆转 circACTN4 上调和下调对 MYC 表达的影响。IF发现与癌旁组织相比，在BC 组织中 MYC 高表达。WB分析表明，FIR的上调和下调可以通过过表达和沉默circACTN4来抵消对MYC及其下游蛋白CDK4和CCND2表达的增强和抑制作用。综上所述，上述结果进一步证明circACTN4可能与FUBP1竞争性结合，阻断FIR对MYC的转录抑制作用，从而促进BC的肿瘤发生和进展。

CircACTN4促进体内异种移植肿瘤的发生和转移

为了评估circACTN4在体内的致癌作用，通过皮下注射和尾静脉注射在裸鼠中建立人BC细胞肿瘤模型。用过表达 circACTN4 慢病毒或 circACTN4 shRNA 慢病毒及其对照感染的 MCF-7 细胞接种雌性裸鼠。结果表明，circACTN4过表达组异种移植肿瘤的体积和重量明显大于对照组，而circACTN4敲低显着抑制了肿瘤生长。与对照组相比，circACTN4的上调明显增加了转移性肺结节的数量，而circACTN4沉默显着抑制了自发性肺转移，侵袭性肿瘤细胞较少。此外，circACTN4 的过表达可以显着促进肿瘤血管生成，而 circACTN4 敲低显着降低肿瘤微血管密度。WB结果显示，与对照组相比，过表达或沉默circACTN4组的异种移植肿瘤组织中MYC的蛋白质水平分别显着增加或减少。生物发光成像结果显示，在circACTN4过表达组中检测到更强和更多的生物发光信号，而circACTN4沉默组中的小鼠与对照组相比显示出更少的生物发光转移数量。与对照组相比，circACTN4 过表达组的小鼠总体存活率较低，肝转移范围更广。最后，我们通过 IHC 确定了 circACTN4 对其靶蛋白 MYC、下游细胞周期相关蛋白 CDK4 和 CCND2 以及细胞增殖相关蛋白 Ki67 的影响。结果表明，circACTN4的上调可以增加肿瘤组织中MYC、CDK4、CCND2和Ki67的表达，而circACTN4的沉默降低了这些蛋白质的表达水平。综上所述，上述结果进一步证明了circACTN4在乳腺癌中的致癌作用，提示circACTN4可以通过激活原癌基因MYC促进乳腺癌的发生和转移。