tiRNA-Gly诱导可变剪切促进肿瘤转移
栏目:最新研究动态 发布时间:2021-07-28
本研究首次发现一个5’-tRNA halves,即tiRNA-Gly通过与RBM17结合诱导可变剪切进而促进乳头状甲状腺癌(PTC)的增殖和迁移......


现今研究表明tRNA-derived small noncoding RNAssncRNAs)主要分为两类:tRNA halves (tiRNAs)fragments (tRFs)。前者在人类实体肿瘤中的的生物学功能吸引了越来越多的关注,但是其在肿瘤发生中的生物学机制仍知之甚少。tiRNAs和剪切相关蛋白之间的相关作用更是为未可知。本研究首次发现一个5’-tRNA halves,即tiRNA-Gly通过与RBM17结合诱导可变剪切进而促进乳头状甲状腺癌(PTC)的增殖和迁移。本文于20217月发表在影响因子7.068的《Journal of Experimental and Clinical Cancer Research》期刊上。


技术路线:




主要实验结果:

1PTC组织中tRFstiRNAs的表达

为了鉴定人PTC组织中的tRFstiRNAs,收集3PTC癌组织和癌旁组间,用于高通量测序,其结果比对至tRNA library GtRNAdb文库,并从中去除线粒体tRNA。最终累计获得1723tRNA片段,其中594个片段只存在于肿瘤组织,136个只存在于癌旁组织(图1A-B)。成分分析显示,肿瘤中tiRNAs的数量远超癌旁组织,而tRFs则主要存在于癌旁(图1C)。火山图可以看出5个在肿瘤组织中显著上调的tRNA片段:5’-tiRNA-Gly-GCC5’-tiRNA-Lys-CTT5’-tiRNA-Glu-CTC5’-tRF-Val-CACpre-tRNA-Ser-TGA (Fig. 1D)。图1E显示tRNA片段1260129312971385明显来源于肿瘤组织。tRNA片段12931297都是5’-tiRNA-Gly-GCC剪切自tiRNA-Gly-GCC的不同部分的。tRNA片段1260切割自tRNA-Glu-CTCtRNA片段1358切割自tRNA-Lys-CTT

为了验证tRFs&tiRNA-Seq数据,作者检测了91PTC组织和癌旁组织中tRFs&tiRNA的表达,其中,tiRNA-Gly在人类PTC组织中的表达水平最高,并显著高于癌旁组织(图1F-G)。WB显示,tiRNA-GlyPTC肿瘤中蛋白表达显著高于癌旁,但是tRNA-Gly的表达在癌和癌旁中无显著差异(图1H)。总之,tiRNA-Gly可能在PTC的进展中起致癌作用。


1PTC组织中tRFstiRNAs的表达

 

2、在小鼠模型中,tiRNA-Gly调节PTC细胞的增殖和迁移,并影响肿瘤生长

首先检测了tiRNA-Gly3PTC细胞系中的表达,如图2A所示,K1细胞系中tiRNA-Gly的表达显著低于BCPAPTPC-1细胞系。因此,对于功能获得性实验,合成带有5’磷酸末端的tiRNA-Gly转染至K1细胞系(图2B)。结果发现,与对照组相比,tiRNA-Gly显著促进K1细胞的增殖和迁移(图2C-D)。对于功能缺失实验,在BCPAPTPC-1细胞系中转染siRNA干扰tiRNA-Gly的表达,结果显示细胞的增殖和迁移都显著下降(图2E-G)。体内实验得出了类似的结果,干扰tiRNA-Gly表达导致肿瘤体积减小,Ki67表达下降。总之,体内体外实验都表明tiRNA-GlyPTC的恶性因子。


2 tiRNA-Gly在体内外调节PTC细胞的恶性活动

 

3tiRNA-Gly直接与RBM17相互作用,调控RBM17PTC细胞中的表达

为了探究tiRNA-Gly在促癌中分子机制,作者合成了生物素标记的tiRNA-Gly及其反义序列,进行RNA pull-down实验,进而挖掘K1细胞中与tiRNA-Gly相互作用的蛋白。结果发现了一个50KD左右大小的条带,选择经质谱测定肽数> 3和独特肽数> 3的蛋白,获得了5个可能的tiRNA-Gly相互作用蛋白,其中RBN17通过了WB验证(图2B)。RIP实验也证实tiRNA-GlyRBM17抗体组富集(图3C)。进一步RIP实验表明,tiRNA-GlyRBM17全长序列中显著富集,但在UHM截断后的序列中富集度显著下降,表明tiRNA-GlyRBM17的相互作用依赖UHM(图3D)。此外,与tiRNA-Gly的相互作用促进了K1细胞RBM17从细胞质转移到细胞核,虽然tiRNA-Gly主要定位于细胞质,但同时导致K1细胞胞质RBM17蛋白水平降低,核RBM17蛋白水平升高(图3E-G)。因此,这些研究表明tiRNA-GlyRBM17UHM结合促进RBM17的核转运。

鉴于以上结果,作者想进一步探究tiRNA-GlyRBM17作用的分子结果。结果显示,tiRNA-Gly可提高总RBM17蛋白的水平,但是不影响RBM17mRNA水平(图3H-I)。随后,用蛋白质合成抑制剂环己胺(CHX)处理细胞,tiRNA-Gly转染后增加了K1细胞内源性RBM17蛋白的半衰期,而β-actin作为对照(图3J)。此外,蛋白酶体抑制剂MG132处理后,内源性RBM17在转染tiRNA-GlyK1细胞中的积累量大大高于转染siRNA-NCK1细胞,表明tiRNA-Gly抑制了蛋白酶体依赖性的PTC细胞中RBM17的降解(图3K)。此外,tiRNA-Gly的过表达显著抑制了泛素化RBM17的水平(图3L)。综上所述,tiRNA-Gly可以稳定RBM17蛋白通过泛素/蛋白酶体依赖性降解。


3tiRNA-Gly直接与RBM17结合,调控RBM17PTC细胞中的表达

 

4RBM17促进PTC细胞的增殖和迁移,并在PTC肿瘤组织中升高

接下来探究RBM17PTC细胞中的功能,RBM17mRNA和蛋白表达在K1细胞系中远低于TPC-1BCPAP细胞,其表达趋势类似于tiRNA-Gly(图4A-B)。于是构建了RBM17过表达的K1细胞系,发现其增殖和迁移曾丽显著增加(图4C-F)。RBM17敲低则效果相反(图4G-J)。此外,RBM蛋白表达在PTC肿瘤组织中显著高于癌旁组织(图4K)。以上结果表明RBM17的作用和tiRNA-Gly相似,在PTC中促进肿瘤进展。


4 RBM17促进PTC细胞的增殖和迁移

 

5RBM17的衰减抑制了tiRNA-GlyPTC细胞的影响,RBM17PTC组织中的表达受tiRNA-Gly的调控

随后,作者分别检测了人PTC组织中tiRNA-Gly高表达和tiRNA-Gly低表达的组织样本中RBM17的表达水平,结果发现与预期一致,tiRNA-Gly高表达组RBM17的表达也显著高于tiRNA-Gly低表达组(图5A)。进行了类似于拯救实验,即过表达tiRNA-Gly组,敲除RBM17组,以及过表达tiRNA-Gly的同时敲除RBM17组,结果表明,tiRNA-Gly过表达+siRBM17同时处理可以部分消除单独处理时引起的TPC-1BCPAP细胞增殖和迁移的改变(图5B-C)。体内实验表明,tiRNA-Gly敲低导致RBM17的表达急剧性下降(图5D)。总之,tiRNA-GlyPTC增殖和迁移的作用依赖于RBM17


5 tiRNA-GlyRBM17之间的关系

 

6tiRNA-Gly通过RBM17调节增殖或迁移相关基因的选择性剪接

由于RBM17是一种参与mRNA选择性剪接的剪接体蛋白,研究tiRNA-Gly在与RBM17结合时是否调节下游基因的选择性剪接将是一项有趣的研究。对过表达tiRNA-Gly后的K1细胞系进行RNA测序,所有的选择性剪切事件如6A所示,外显子跳跃(cassette外显子)占37.67%A5SSs剪接占6.78%A3SSs剪接占4.99%,备选第一外显子(AltStart)剪接占18.19%,备选末端外显子(AltEnd)剪接占18.74%,互斥事件(MEXs)占5.12%,内含子保留剪接(IR)占8.51%。外显子跳跃显然是tiRNA-Gly诱导的最频繁的选择性剪接事件。MAP4K4POSTNHACE1DPP9BRCA1是外显子跳跃导致表达变化最大的基因。tiRNA-Gly诱导了MAK4K416外显子的跳跃,POSTN21外显子的跳跃,HACE18外显子的跳跃,DPP921外显子的跳跃和BRCA113外显子的跳跃(图6B)。如图6C-D所示,升高的tiRNA-Gly诱导了MAP4K4一个截断型(NM_4834.4)mRNA水平,降低了一个长型(NM_1242560.1)mRNA水平,而下调的RBM17则起相反的作用。重要的是,RBM17的敲除阻断了由tiRNA-Gly诱导的MAP4K4截断变体(NM_4834.4)的增加,表明tiRNA-Gly诱导的选择性剪接依赖于RBM17

MAP4K4是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员,可以通过磷酸蛋白MEKK1激活MAPK通路。构建pCMV-NM_4834.4pCMV-NM_1242560.1质粒,分别转染K1细胞,并通过qRT-PCR验证了其转染效率(图6E)。这两种变异显著增强了K1细胞的增殖和迁移。而截断型(NM_4834.4)比长型(NM_1242560.1)对增殖和迁移的影响更强(图6F-G)。此外,MEKK1MKK4JNKMEKERK的总磷酸化水平未发生改变,而NM_4834.4NM_1242560.1两种变体转染组的磷酸化水平均高于对照组。更重要的是,与NM_1242560.1相比,NM_4834.4对磷酸- MEKK1MKK4JNKMEKERK的影响更强,这表明MAP4K4中第16外显子的剪切影响了MAPK通路下游蛋白的磷酸化(图6H)。体内小鼠模型结果证明,注射si-tiRNA-Gly组移植瘤中磷酸化蛋白水平明显降低,而总蛋白水平与生理盐水组相比没有变化(图6I)。这些结果表明,RBM17介导的tiRNA-Gly诱导的MAP4K416外显子剪接可增强PTC细胞的增殖和迁移,并对MAPK通路下游蛋白进行磷酸化。

 

6 tiRNA-Gly通过RBM17调控MAP4K4 mRNA的选择性剪接

 

总之,本文阐明了tiRNA-Gly结合RBM17UHM结构域并促进其易位,导致RBM17蛋白增加,从而诱导PTC细胞中靶基因的选择性剪接,最终促进肿瘤进展。

 

7 理论模型示意图

 

参考文献:

Han Litao., Lai Hejing., Yang Yichen., Hu Jiaqian., Li Zhe., Ma Ben., Xu Weibo., Liu Wanlin., Wei Wenjun., Li Duanshu., Wang Yu., Zhai Qiwei., Ji Qinghai., Liao Tian.(2021). A 5'-tRNA halve, tiRNA-Gly promotes cell proliferation and migration via binding to RBM17 and inducing alternative splicing in papillary thyroid cancer. J Exp Clin Cancer Res, 40(1), 222. doi:10.1186/s13046-021-02024-3