tiRNA-Gly诱导可变剪切促进肿瘤转移

现今研究表明tRNA-derived small noncoding RNAs（sncRNAs）主要分为两类：tRNA halves (tiRNAs)和fragments (tRFs)。前者在人类实体肿瘤中的的生物学功能吸引了越来越多的关注，但是其在肿瘤发生中的生物学机制仍知之甚少。tiRNAs和剪切相关蛋白之间的相关作用更是为未可知。本研究首次发现一个5’-tRNA halves，即tiRNA-Gly通过与RBM17结合诱导可变剪切进而促进乳头状甲状腺癌（PTC）的增殖和迁移。本文于2021年7月发表在影响因子7.068的《Journal of Experimental and Clinical Cancer Research》期刊上。

技术路线：

主要实验结果：

1、人PTC组织中tRFs和tiRNAs的表达

为了鉴定人PTC组织中的tRFs和tiRNAs，收集3对PTC癌组织和癌旁组间，用于高通量测序，其结果比对至tRNA library GtRNAdb文库，并从中去除线粒体tRNA。最终累计获得1723个tRNA片段，其中594个片段只存在于肿瘤组织，136个只存在于癌旁组织（图1A-B）。成分分析显示，肿瘤中tiRNAs的数量远超癌旁组织，而tRFs则主要存在于癌旁（图1C）。火山图可以看出5个在肿瘤组织中显著上调的tRNA片段：5’-tiRNA-Gly-GCC，5’-tiRNA-Lys-CTT，5’-tiRNA-Glu-CTC，5’-tRF-Val-CAC，pre-tRNA-Ser-TGA (Fig. 1D)。图1E显示tRNA片段1260，1293，1297和1385明显来源于肿瘤组织。tRNA片段1293和1297都是5’-tiRNA-Gly-GCC剪切自tiRNA-Gly-GCC的不同部分的。tRNA片段1260切割自tRNA-Glu-CTC，tRNA片段1358切割自tRNA-Lys-CTT。

为了验证tRFs&tiRNA-Seq数据，作者检测了91对PTC组织和癌旁组织中tRFs&tiRNA的表达，其中，tiRNA-Gly在人类PTC组织中的表达水平最高，并显著高于癌旁组织（图1F-G）。WB显示，tiRNA-Gly在PTC肿瘤中蛋白表达显著高于癌旁，但是tRNA-Gly的表达在癌和癌旁中无显著差异（图1H）。总之，tiRNA-Gly可能在PTC的进展中起致癌作用。

图1人PTC组织中tRFs和tiRNAs的表达

2、在小鼠模型中，tiRNA-Gly调节PTC细胞的增殖和迁移，并影响肿瘤生长

首先检测了tiRNA-Gly在3株PTC细胞系中的表达，如图2A所示，K1细胞系中tiRNA-Gly的表达显著低于BCPAP和TPC-1细胞系。因此，对于功能获得性实验，合成带有5’磷酸末端的tiRNA-Gly转染至K1细胞系（图2B）。结果发现，与对照组相比，tiRNA-Gly显著促进K1细胞的增殖和迁移（图2C-D）。对于功能缺失实验，在BCPAP和TPC-1细胞系中转染siRNA干扰tiRNA-Gly的表达，结果显示细胞的增殖和迁移都显著下降（图2E-G）。体内实验得出了类似的结果，干扰tiRNA-Gly表达导致肿瘤体积减小，Ki67表达下降。总之，体内体外实验都表明tiRNA-Gly是PTC的恶性因子。

图2 tiRNA-Gly在体内外调节PTC细胞的恶性活动

3、tiRNA-Gly直接与RBM17相互作用，调控RBM17在PTC细胞中的表达

为了探究tiRNA-Gly在促癌中分子机制，作者合成了生物素标记的tiRNA-Gly及其反义序列，进行RNA pull-down实验，进而挖掘K1细胞中与tiRNA-Gly相互作用的蛋白。结果发现了一个50KD左右大小的条带，选择经质谱测定肽数> 3和独特肽数> 3的蛋白，获得了5个可能的tiRNA-Gly相互作用蛋白，其中RBN17通过了WB验证（图2B）。RIP实验也证实tiRNA-Gly在RBM17抗体组富集（图3C）。进一步RIP实验表明，tiRNA-Gly在RBM17全长序列中显著富集，但在UHM截断后的序列中富集度显著下降，表明tiRNA-Gly和RBM17的相互作用依赖UHM（图3D）。此外，与tiRNA-Gly的相互作用促进了K1细胞RBM17从细胞质转移到细胞核，虽然tiRNA-Gly主要定位于细胞质，但同时导致K1细胞胞质RBM17蛋白水平降低，核RBM17蛋白水平升高（图3E-G）。因此，这些研究表明tiRNA-Gly与RBM17的UHM结合促进RBM17的核转运。

鉴于以上结果，作者想进一步探究tiRNA-Gly与RBM17作用的分子结果。结果显示，tiRNA-Gly可提高总RBM17蛋白的水平，但是不影响RBM17的mRNA水平（图3H-I）。随后，用蛋白质合成抑制剂环己胺(CHX)处理细胞，tiRNA-Gly转染后增加了K1细胞内源性RBM17蛋白的半衰期，而β-actin作为对照（图3J）。此外，蛋白酶体抑制剂MG132处理后，内源性RBM17在转染tiRNA-Gly的K1细胞中的积累量大大高于转染siRNA-NC的K1细胞，表明tiRNA-Gly抑制了蛋白酶体依赖性的PTC细胞中RBM17的降解（图3K）。此外，tiRNA-Gly的过表达显著抑制了泛素化RBM17的水平（图3L）。综上所述，tiRNA-Gly可以稳定RBM17蛋白通过泛素/蛋白酶体依赖性降解。

图3tiRNA-Gly直接与RBM17结合，调控RBM17在PTC细胞中的表达

4、RBM17促进PTC细胞的增殖和迁移，并在PTC肿瘤组织中升高

接下来探究RBM17在PTC细胞中的功能，RBM17的mRNA和蛋白表达在K1细胞系中远低于TPC-1和BCPAP细胞，其表达趋势类似于tiRNA-Gly（图4A-B）。于是构建了RBM17过表达的K1细胞系，发现其增殖和迁移曾丽显著增加（图4C-F）。RBM17敲低则效果相反（图4G-J）。此外，RBM蛋白表达在PTC肿瘤组织中显著高于癌旁组织（图4K）。以上结果表明RBM17的作用和tiRNA-Gly相似，在PTC中促进肿瘤进展。

图4 RBM17促进PTC细胞的增殖和迁移

5、RBM17的衰减抑制了tiRNA-Gly对PTC细胞的影响，RBM17在PTC组织中的表达受tiRNA-Gly的调控

随后，作者分别检测了人PTC组织中tiRNA-Gly高表达和tiRNA-Gly低表达的组织样本中RBM17的表达水平，结果发现与预期一致，tiRNA-Gly高表达组RBM17的表达也显著高于tiRNA-Gly低表达组（图5A）。进行了类似于拯救实验，即过表达tiRNA-Gly组，敲除RBM17组，以及过表达tiRNA-Gly的同时敲除RBM17组，结果表明，tiRNA-Gly过表达+siRBM17同时处理可以部分消除单独处理时引起的TPC-1和BCPAP细胞增殖和迁移的改变（图5B-C）。体内实验表明，tiRNA-Gly敲低导致RBM17的表达急剧性下降（图5D）。总之，tiRNA-Gly对PTC增殖和迁移的作用依赖于RBM17。

图5 tiRNA-Gly与RBM17之间的关系

6、tiRNA-Gly通过RBM17调节增殖或迁移相关基因的选择性剪接

由于RBM17是一种参与mRNA选择性剪接的剪接体蛋白，研究tiRNA-Gly在与RBM17结合时是否调节下游基因的选择性剪接将是一项有趣的研究。对过表达tiRNA-Gly后的K1细胞系进行RNA测序，所有的选择性剪切事件如6A所示，外显子跳跃（cassette外显子）占37.67%，A5SSs剪接占6.78%，A3SSs剪接占4.99%，备选第一外显子(AltStart)剪接占18.19%，备选末端外显子（AltEnd）剪接占18.74%，互斥事件（MEXs）占5.12%，内含子保留剪接（IR）占8.51%。外显子跳跃显然是tiRNA-Gly诱导的最频繁的选择性剪接事件。MAP4K4、POSTN、HACE1、DPP9和BRCA1是外显子跳跃导致表达变化最大的基因。tiRNA-Gly诱导了MAK4K4第16外显子的跳跃，POSTN第21外显子的跳跃，HACE1第8外显子的跳跃，DPP9第21外显子的跳跃和BRCA1第13外显子的跳跃（图6B）。如图6C-D所示，升高的tiRNA-Gly诱导了MAP4K4一个截断型(NM_4834.4)的mRNA水平，降低了一个长型(NM_1242560.1)的mRNA水平，而下调的RBM17则起相反的作用。重要的是，RBM17的敲除阻断了由tiRNA-Gly诱导的MAP4K4截断变体(NM_4834.4)的增加，表明tiRNA-Gly诱导的选择性剪接依赖于RBM17。

MAP4K4是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员，可以通过磷酸蛋白MEKK1激活MAPK通路。构建pCMV-NM_4834.4和pCMV-NM_1242560.1质粒，分别转染K1细胞，并通过qRT-PCR验证了其转染效率（图6E）。这两种变异显著增强了K1细胞的增殖和迁移。而截断型(NM_4834.4)比长型(NM_1242560.1)对增殖和迁移的影响更强（图6F-G）。此外，MEKK1、MKK4、JNK、MEK、ERK的总磷酸化水平未发生改变，而NM_4834.4和NM_1242560.1两种变体转染组的磷酸化水平均高于对照组。更重要的是，与NM_1242560.1相比，NM_4834.4对磷酸- MEKK1、MKK4、JNK、MEK、ERK的影响更强，这表明MAP4K4中第16外显子的剪切影响了MAPK通路下游蛋白的磷酸化（图6H）。体内小鼠模型结果证明，注射si-tiRNA-Gly组移植瘤中磷酸化蛋白水平明显降低，而总蛋白水平与生理盐水组相比没有变化（图6I）。这些结果表明，RBM17介导的tiRNA-Gly诱导的MAP4K4第16外显子剪接可增强PTC细胞的增殖和迁移，并对MAPK通路下游蛋白进行磷酸化。

图6 tiRNA-Gly通过RBM17调控MAP4K4 mRNA的选择性剪接

总之，本文阐明了tiRNA-Gly结合RBM17的UHM结构域并促进其易位，导致RBM17蛋白增加，从而诱导PTC细胞中靶基因的选择性剪接，最终促进肿瘤进展。

图7 理论模型示意图

参考文献：

Han Litao., Lai Hejing., Yang Yichen., Hu Jiaqian., Li Zhe., Ma Ben., Xu Weibo., Liu Wanlin., Wei Wenjun., Li Duanshu., Wang Yu., Zhai Qiwei., Ji Qinghai., Liao Tian.(2021). A 5'-tRNA halve, tiRNA-Gly promotes cell proliferation and migration via binding to RBM17 and inducing alternative splicing in papillary thyroid cancer. J Exp Clin Cancer Res, 40(1), 222. doi:10.1186/s13046-021-02024-3