METTL3通过m6A修饰抑制APC表达促进食管癌进展
栏目:最新研究动态 发布时间:2021-07-29
食道癌是世界上第六大最常见的肿瘤,据报道患者5年生存率只有12-20%。N 6 -甲基腺苷 (m6A) 修饰是真核生物 mRNA 中......

食道癌是世界上第六大最常见的肿瘤,据报道患者5年生存率只有12-20%N 6 -甲基腺苷 (m6A) 修饰是真核生物 mRNA 中最丰富的 RNA 修饰,主要由 m 6 A 调节剂介导。m 6 A 修饰调节 RNA 稳定性和翻译效率、染色质状态、替代聚腺苷酸化和前体 mRNA 剪接。

今天我们来讲一篇刊登在Nature CommunicationsIF=14.91)上的一篇文章,题名为METTL3 promotes tumour development by decreasing APC expression mediated by APC mRNA N 6-methyladenosine-dependent YTHDF binding

上调 METTL3 ESCC 患者的不良生存相关

为探讨食管癌中中METTL3的表达谱,分析了肿瘤基因组图谱(TCGA)数据,发现与11个相邻的正常食管上皮组织相比,95个食管癌标本中METTL3的表达显著上调。对包含81ESCC标本和邻近正常食管上皮组织的组织芯片进行IHC染色显示,ESCC组织中的METTL3表达水平显著高于配对邻近正常组织。Kaplan-Meier分析显示,高表达METTL3的患者总生存时间比低表达METTL3的患者短。9种不同ESCC细胞系中METTL3 mRNA和蛋白质的表达水平高于Het-1a永生化正常食管上皮细胞。这些结果表明,METTL3在食管鳞癌中表达上调,并与食管鳞癌患者生存时间呈负相关。


METTL3促进小鼠ESCC细胞增殖和肿瘤生长

为了确定METTL3在细胞增殖中的作用,通过转染METTL3 shRNAs来去除ESCC细胞中的METTL3。发现METTL3缺失减少了这些细胞的增殖和集落数。通过在KYSE180KYSE450中重组表达METTL3,这些抑制作用被消除。




   接下来在
KYSE450细胞中建立四环素诱导的METTL3表达。四环素治疗以剂量依赖的方式增加METTL3的表达,相应地引起细胞增殖水平的增加和集落形成水平的增加。与野生型(WTMETTL3的过表达相比,在ESCC细胞中METTL3非活性突变体的过表达未能促进细胞生长和增殖。这些结果有力地表明,METTL3促进肿瘤细胞增殖依赖于其表达水平和完整的活性。

为了确定METTL3在小鼠肿瘤生长中的作用,将KYSE180KYSE450细胞皮下注射到裸鼠体内,发现METTL3缺失降低了肿瘤大小、体积和重量。与表达METTL3非活性突变体引起的有限效应相比,WT METTL3过表达极大地促进了肿瘤生长。这些结果表明METTL3的表达有助于小鼠肿瘤的生长。

METTL3 介导 APC mRNA 上的 m6A 上调

为了确定METTL3促进肿瘤细胞增殖的机制,检测了METTL3ESCC细胞上转录调节中的作用。METTL3缺失降低了KYSE180细胞中m6A的总丰度。甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)和m6A特异性抗体,然后进行RNA测序(MeRIP-seq),发现KYSE180mRNA中鉴定的m6A位点与RRACH序列一致。m6A信号在mRNAs的终止密码子和3-非翻译区富集。

MeRIP-seqMETTL3缺失减少了1101个基因的mRNAs1199m6A峰。转录组测序发现METTL3缺失调节2973个基因的表达。二者取交集发现共有93个基因重叠。MeRIP-seq中细胞成分(CC)项的基因本体(GO)富集分析表明,在METTL3缺失的KYSE180细胞中,β-连环蛋白降解复合物(的基因组(包括APC)中m6A水平显著降低。

APC是促进β-连环蛋白降解调节因子。m6A峰位于APC末端密码子区域附近的最后一个外显子,METTL3缺失降低了APC mRNAm6A水平。分析显示,有三个腺苷碱基甲基化,并且在METTL3缺失导致的APC mRNA m6A峰值下降范围内。这些结果表明METTL3调节apcmrnam6A水平,这种水平在许多类型的癌细胞中都很高。

m6A-RIP和实时定量PCR分析表明,在KYSE180细胞中,METTL3缺失后,APC mRNA中的m6A水平显著降低。相反,METTL3过表达增加了KYSE180细胞中APC mRNAm6A水平,并且这种增加被METTL14缺失所消除。此外,带有抗METTL3RIP显示METTL3KYSE180KYSE450细胞中的APC mRNA结合。这些结果表明METTL3apcmrna结合并以METTL14依赖的方式增强其m6A水平。


APC mRNA 上的 METTL3 依赖性 m6A 上调抑制 APC 表达

为了确定METTL3依赖的m6A调控对APC表达的影响,构建了一个荧光素酶报告基因,荧光素酶分析显示,METTL3缺失大大增加了WT APC的荧光素酶活性,而突变的APC提高了荧光素酶活性并使该活性抵抗METTL3缺失的调节。相反,METTL3过表达抑制了WT-APC的荧光素酶活性,但没有突变的APC。这些结果表明METTL3介导的m6A水平的APC mRNA上调抑制了APC的表达。

与这一发现一致,METTL3缺失增加了APC mRNA和蛋白质表达(,并且这些增加被KYSE450细胞中rMETTL3的重组表达所消除。此外,METTL3的过表达降低了KYSE450细胞中APC的表达,四环素剂量依赖性增加的METTL3表达水平与APC水平呈负相关。相反,METTL3非活性突变体与WT对应物不同,未能调节APC表达。值得注意的是,ESCC细胞中的METTL14缺失消除了METTL3的过度表达降低了APC的表达。这些结果表明,在ESCC细胞中,METTL3METTL14共同介导的APC mRNA m6A上调抑制了APC mRNA和蛋白的表达。


METTL3 增强 APC mRNA m6A 和随后的 YTHDF 结合抑制 APC 表达

YTHDF1-3介导mRNA降解,针对YTHDF1的抗体进行RIP分析,实时定量PCR分析显示,在KYSE180中,与APC mRNA结合的YTHDF2的数量远远多于YTHDF1YTHDF3的数量,并且由于METTL3缺失而减少。这些结果表明METTL3增加了APC mRNAm6A,在很大程度上促进了YTHDF2APC mRNA的结合。

为了研究YTHDF2APC mRNA结合在APC表达中的作用,我们去除了YTHDF2,这增加了KYSE450细胞中APCmRNA(图5d和补充图5e)和蛋白质表达。YTHDF13的联合缺失进一步增加了这些细胞中APCmRNA和蛋白质表达。此外,还进行了荧光素酶报告子分析,结果表明,缺失YTHDF2增强了由含m6AWT APC CDS序列驱动的荧光素酶活性,而突变的APC增强了荧光素酶活性,并使该活性抵抗了YTHDF2缺失的调节。此外,METTL3过表达抑制由WT APC CDS序列驱动的荧光素酶活性通过YTHDF2耗竭恢复,其不影响突变的APC增强的荧光素酶活性。这些结果表明METTL3增加了APC mRNAm6A,随后的YTHDF结合抑制了APC的表达。


METTL3降低APC表达,促进β-catenin介导的下游基因表达、有氧糖酵解、ESCC细胞增殖和肿瘤发展

APC功能的丧失使β-连环蛋白稳定,从而诱导下游基因(CCND1MYC)的表达。CCND1促进细胞周期,c-Myc增强有氧糖酵解。正如预期的那样,METTL3缺失增强了KYSE180细胞中APC的表达,降低了β-连环蛋白、细胞CCND1c-MycPKM2的表达。此外,METTL3缺失降低了葡萄糖摄取、乳酸产生、细胞增殖和细胞集落数。值得注意的是,这种METTL3缺失引起基因表达(图6a)、糖酵解(图6bc)、细胞增殖(补充图6f)和集落形成的抑制在很大程度上被这些细胞中的APC缺失所消除。相反,METTL3过度表达引起葡萄糖消耗和乳酸产生的增加,这被YTHDF2消耗所消除。这些结果表明METTL3降低APC表达,促进β-catenin介导的下游基因表达、有氧糖酵解和ESCC细胞增殖。




为了确定METTL3诱导的APC表达下调在小鼠肿瘤生长中的作用,将KYSE180细胞皮下注射到裸鼠体内。发现通过APC去除,METTL3去除使肿瘤大小、体积和重量减小,并且肿瘤组织中的乳酸量恢复。此外,IHC染色显示,METTL3缺失增加AP的表达,相应地减少了肿瘤组织中β-连环蛋白、cyclind1c-MycPKM2的表达。这些结果表明METTL3抑制APC的表达可以促进肿瘤的发展。

APC表达下调与食管鳞癌标本METTL3上调及食管鳞癌患者预后不良相关

为了确定METTL3抑制APC表达的临床相关性,分析TCGA数据, APC mRNA表达与ESCCMETTL3 mRNA表达呈负相关。发现与正常组织相比,ESCC标本中APC的表达显著下调。81ESCC标本的IHC染色观察到METTL3蛋白表达与APC蛋白表达呈负相关,METTL3蛋白表达与β-连环蛋白表达呈正相关。此外,APC的高表达与ESCC患者的长期总生存时间显著相关。这些结果提示APC表达下调与METTL3表达上调及ESCC患者预后不良相关。