SUMOylation促进细胞外囊泡介导的lncRNA ELNAT1的传递和膀胱癌的淋巴结转移

   小泛素修饰(SUMO)结合称为SUMO修饰，其作为生物活性分类的诱导剂分子进入细胞外囊泡(EVs)，触发淋巴管生成，进一步驱动肿瘤淋巴结(LN)转移，但确切的机制仍不清楚。本研究发现，SUMOylation促进细胞外囊泡介导的lncRNA ELNAT1的传递和膀胱癌的淋巴结转移。该文于2021年4月发表在《The Journal of Clinical Investigation》IF: 14.808。

技术路线：

结果：
 1. SUMOylation参与膀胱癌的淋巴结转移

为了探讨SUMOylation在膀胱癌（BCa）的淋巴结（LN）转移中的作用，作者基于淋巴癌与TCGA数据库中比较SUMOylation的表达谱，发现BCas中UBC9的高表达，同时生成分析显示，与UBC9表达较低的患者相比，UBC9表达较高的患者总生存率（OS）和无病生存期（DFS）较低（Figure 1 A-E）。为了证明UBC9在LN转移中的作用，作者通过242例的BCas患者样本，发现UBC9在LN转移过程中高表达（Figure 1 F）。接下来为了证明，SUMOylation对BCas诱导的淋巴内皮管的形成和迁移作用，通过其特异性抑制剂阻断SUMOylation （2D-08）明显抑制了该诱导过程（Figure 1 G-I）。以上数据表明，UBC9异常高表达与膀胱癌进展和淋巴结转移正相关，SUMOylation参与膀胱癌的淋巴结转移。

                                                                                                Figure 1 SUMOylation参与膀胱癌的淋巴结转移 

2. EVs介导的ELNAT1过表达与淋巴结转移相关

EVs介导的lncRNA转运是肿瘤细胞与TME之间通过信号转导发生的一个关键过程。作者采集各5例的健康志愿者与BCas患者的尿液，通过NGS测序确定了EVs中lncRNA的整体表达谱，结合与SUMOylation途径的相关性，最终筛选出EVs中异常高表达的lncRNA ELNAT1（Figure 2 A, B）。结合BCa与LN转移，ELNAT1在BCa与LN转移中高表达（Figure 2 C, D），并且ELNAT1过表达与BCa患者预后不良相关（Figure 2 E, F）。另外，在瘤内和瘤旁区域ELNAT1的表达与淋巴管密度正相关（Figure 2 G, H），提示ELNAT1广泛参与BCa的淋巴管生成。

为了证明ELNAT1与BCa分泌的EV的关系，作者从BCa细胞培养基中分离出EVs，采用透射电子显微镜(TEM)、纳米粒子跟踪分析(NTA)及对EVs的蛋白标志物检测，证明了作者准确分离出BCa分泌的EV（Figure 2 J-L）。并且从BCa患者和健康志愿者尿液样本中分离的EVs中检测ELNAT1的表达，发现ELNAT1在BCa分泌的EV中过表达（Figure 2 I）。以上数据表明，EVs介导的ELNAT1过表达与淋巴结转移相关。

                                                                                              Figure 2 EVs介导的ELNAT1过表达与淋巴结转移相关

3. EVs介导的ELNAT1促进BCa体内外淋巴管生成和淋巴转移

为了确定EV介导的ELNAT1是否促进体外淋巴管生成，作者用HLECs孵育BCa细胞分泌的EVs的检测管形成和迁移。研究发现，干扰ELNAT1基因会破坏UM-UC-3和T24细胞分泌EVs诱导HLECs管形成和迁移的能力（Figure 3 A-C），这些结果表明EVs介导的ELNAT1诱导了体外淋巴管生成。

为了确定EVs介导的ELNAT1在体内促进LN转移，首先构建一个小鼠腘窝的淋巴结转移模型。小鼠随机分为2组（n = 12），每3天接受由载体（UM-UC-EV _Vector）或ELNAT1（UM-UC-3-EV _ELNAT1）转染的UM-UC-3细胞分泌的EVs 瘤内注射，当原发肿瘤大小达到200mm³时采集肿瘤和腘窝的LNs（Figure 3D）。结果发现，通过体内成像系统（IVIS）发现，与UM-UC-EV _Vector相比，UM-UC-3-EV _ELNAT1促进了UM-UC-3细胞向腘窝LNs的转移，LNs体积更大（Figure 3 E-       I）。

由于淋巴管生成是淋巴结转移的关键步骤，因此进一步评估了EVs介导的ELNAT1在体内对淋巴管生成的影响。结果显示，UM-UC-3-EV _ELNAT1组显著增加了小鼠足底肿瘤瘤内和瘤旁区域的淋巴管内皮透明质酸受体1阳性（LYVE-1 positive）（Figure 3 J, K）。以上结果表明，EVs介导的ELNAT1促进BCa体内淋巴管生成和淋巴结转移。

Figure 3 EVs介导的ELNAT1促进BCa体内外淋巴管生成和淋巴转移

4. ELNAT1直接与hnRNPA1相互作用

由于lncRNA的分子功能与其亚细胞定位相关，通过FISH和亚细胞定位实验发现ELNAT1在UM-UC-3 和T24 细胞的细胞质和细胞核均有表达（Supplemental Figure7 A, B）。并且通过RNA-pull down实验，发现在分子量35~40 kDa上有明显的条带（Figure 4 A）。对此，通过质谱（MS）和Western blot分析显示，hnRNPA1是最丰富的ELNAT1相互作用蛋白（Figure 4 B-D）。荧光染色和RNA免疫沉淀（RIP）证实了ELNAT1和hnRNPA1在UM-UC-3和T24细胞中的共定位，并且ELNAT1通过内源性hnRNPA1富集（Figure 4 E, F），进一步验证了ELNAT1和hnRNPA1之间的相互作用。

此外，为进一步验证ELNAT1与hnRNPA1相互作用区域，使用ELNAT1不同序列缺失进行RNA-pull down分析，以评估ELNAT1和hnRNPA1结合所需的区域。结果发现，ELNAT1序列中600-750 nt位置是其与hnRNPA1交互作用区域（Figure 4 G, H）。并通过POSTAR2预测ELNAT1在610-680 nt区域的茎环结构可能被hnRNPA1识别（Figure 4 I），而当这一区域缺失时，hnRNPA1减弱对ELNAT1的富集（Figure 4 J）。因此，这表明这些特定的序列（610-680 nt）对ELNAT1 hnRNPA1的相互作用至关重要。

Figure 4 ELNAT1直接与hnRNPA1相互作用

5. ELNAT1与UBC9启动子形成DNA-RNA三联体，通过招募hnRNPA1增强H3K4me3修饰

为了探索ELNAT1诱导BCa淋巴转移的分子机制，我们使用NGS检测过表达ELNAT1的BCa细胞和对照细胞（Figure 5 A），由于SUMOylation已经被证明可以调节特异性RNA的识别，并参与RNA分选进入EVs的过程，因此鉴定ELNAT1的SUMOylation相关靶基因。在受ELNAT1调控的925个基因中，作者发现UBC9是SUMOylation相关基因变化最显著的（Figure 5 B-D）。接着通过RNA纯化（ChIRP）检验ELNAT1与UBC9中P1（153 ~ 143 bp）启动子区域存在生理相互作用（Figure 5 E, F）。CD光谱证实ELNAT1/UBC9 TTS1组在270 ~ 280 nm处有一个显著的正峰，在210 nm处有一个负峰。在FENDRR/PITX2阳性对照组中也有类似的发现（Figure 5 G, H）。FRET技术分析显示, 与ELNAT1 / UBC9 TTS1组相比，荧光强度发生了巨大的变化：从520 nm到570–580 nm,荧光强度控制单链RNA / UBC9 ssRNA / UBC9 TTS1集团,这与FENDRR / PITX2阳性对照组类似（Figure 5 I, J）。

此外，ChIP分析显示，过表达ELNAT1增加了hnRNPA1和组蛋白甲基化（H3K4me3）在UBC9启动子上的富集，而通过删除hnRNPA1的ELNAT1结合位点则抑制了富集（Figure 5 K, L）。同时，ELNAT1沉默显著降低了UM-UC-3和T24细胞UBC9启动子的hnRNPA1占用率和H3K4me3甲基化（Figure 5 M, N），这证明了hnRNPA1通过调节UBC9启动子上的组蛋白甲基化，促进ELNAT1诱导UBC9的转录激活。以上结果说明，ELNAT1与UBC9启动子形成DNA-RNA三联体，通过招募hnRNPA1增强H3K4me3修饰。

Figure 5 ELNAT1与UBC9启动子形成DNA-RNA三联体，通过招募hnRNPA1增强H3K4me3修饰

6. ELNAT1通过UBC9诱导的hnRNPA1的SUMOylation被封装到EVs中

UBC9可以催化靶蛋白的SUMOylation来调节它们与生物分子的相互作用和细胞运输。Figure 6 A显示，通过co-IP分析，观察到一个明显的15~25 kDa条带被hnRNPA1特异性富集。此外，IP分析显示UBC9过表达增强了hnRNPA1的SUMO2连接，表明UBC9诱导hnRNPA1的SUMOylation（Figure 6 B）。将hnRNPA1中SUMOylation修饰的位点赖氨酸3 （K3）和赖氨酸113 （K113）用精氨酸替代（Figure 6 C），并通过co-IP分析表明，证明了hnRNPA1中SUMOylation修饰的位点是K113（Figure 6 D）。ELNAT1过表达上调了hnRNPA1K113的SUMO化，而敲除UBC9则消除了这个影响（Figure 6 E）。

另外，之前报道过hnRNPA1将miR-196a和miR-320加载到EVs中，本研究ELNAT1表现出的EVs-细胞比率与miR-196a和miR-320相当（Figure 6 F）。hnRNPA1沉默显著抑制了ELNAT1在BCa细胞分泌的EVs中的富集（Figure 6 G）。此外，缺失的ELNAT1（包含hnRNPA1结合位点的610-680 nt）主要保留在BCa细胞中（Figure 6 H），证实了ELNAT1通过与hnRNPA1的相互作用被加载到EVs中。

验证SUMOylation是否有助于hnRNPA1介导的EVs包裹ELNAT1。在BCa细胞中，hnRNPA1中K113位点突变使BCa细胞分泌的EVs中ELNAT1表达降低，沉默UBC9降低了BCa细胞分泌的EVs中ELNAT1的富集（Figure 6 I, J）。与hnRNPA1 WT沉默相比，hnRNPA1沉默后，转染hnRNPA1_K113R并不能恢复EVs介导的ELNAT1下调（Figure 6 K）。共聚焦显微镜显示，在UBC9沉默或hnRNPA1_K113R突变后，ELNAT1在CD36标志的多囊泡（MVBs）中的积累明显下降（Figure 6 L），表明ELNAT1进入EVs受hnRNPA1的SUMO化调控。

Figure 6 ELNAT1通过UBC9诱导的hnRNPA1的SUMOylation被封装到EVs中

7. EVs介导的ELNAT1被HLECs内化以诱导淋巴管生成

共聚焦显微镜显示HLECs中PKH67标记EVs孵育后的点状荧光强度（Figure 7 A），表明HLECs内化了BCa分泌的EVs。此外,孵化UM-UC-3-EV_ELNAT1显著上调HLECs中ELNAT1表达,而孵化T24-EV_si-ELNAT1，则T24细胞分泌的EVs中ELNAT1表达下调，则削弱了HLECs中EVs诱导ELNAT1过表达的能力（Figure 7 B, C）。

为了排除淋巴血管生成是由内源性ELNAT1激活HLECs中诱导的可能性，构建了ELNAT1-KO HLECS ELNAT1（HLECs_ELNAT1-KO）模型（Figure 7 D, E）。与HLECs_ELNAT1-WT一致，我们观察到，EVs介导的ELNAT1过表达增强了HLECs_ELNAT1-KO的管状形成和迁移能力，而下调ELNAT1则抑制了BCa细胞分泌EVs诱导HLECs_ELNAT1-KO管状形成和迁移的能力（Figure 7 F-H）。这表明BCa细胞分泌的EVs通过运输EVs介导的ELNAT1促进淋巴管生成，而不是转录激活内源性的ELNAT1。综上所述，这些结果表明EVs介导的ELNAT1被HLECs内化诱导BCa淋巴管生成。

Figure 7 EVs介导的ELNAT1被HLECs内化以诱导淋巴管生成

8. EVs介导的ELNAT1上调HLECs中SOX18的表达

qRT-PCR分析UM-UC-3-EV1载体或UM-UC-3-EV_ELNAT1处理的HLECs中淋巴管生成相关基因的表达，结果显示SRY-box转录因子18 （SOX18）是最明显的与EVs介导的ELNAT1表达正相关的基因（Figure 8 A, B）。此外，ChIRP分析表明EVs介导的ELNAT1与HLECs中SOX18启动子的771~786 bp（p4）直接相互作用（Figure 8 C, D）。SOX18-p4区域的突变降低了EVs介导的ELNAT1诱导的荧光素酶活性（Figure 8 E, F），表明SOX18-p4对于EVs介导的ELNAT1诱导HLECs中SOX18的上调至关重要。hnRNPA1和H3K4me3在SOX18启动子上的富集与EVs介导的ELNAT1表达显著相关（Figure 8 G, J）。EVs介导的ELNAT1过表达增强了HLECs的管形成和迁移能力，而干扰SOX18则HLECs的管形成和迁移能力受损（Figure 8 K, M），表明SOX18是EVs介导的ELNAT1驱动体外BCa淋巴管生成所必需的。综上所述，这些结果表明，EVs介导的ELNAT1通过转录上调HLECs中SOX18的表达来促进BCa淋巴管生成。

Figure 8 EVs介导的ELNAT1上调HLECs中SOX18的表达

9. 阻断SUMOylation抑制EVs介导的ELNAT1诱导的淋巴结转移

用si-NC或si-UBC9#1转染的对照或ELNAT1过表达UM-UC-3细胞分泌的EVs处理HLECs，结果显示过表达ELNAT1显著促进了体外BCa细胞分泌的EVs诱导淋巴血管生成，而沉默UBC9逆转了这一作用（Figure 9 A-C）。IVIS证明UM-UC-3-EV_ELNAT1增强了体内腘窝淋巴结转移，而沉默UBC9抑制了这种作用（Figure 9 D, E）。UM-UC-3-EV_ELNAT1+ siUBC9 #1组的腘窝LNs体积比UM-UC-3-EV_ELNAT1组小（Figure 9 F）。与UM-UC-3-EV_Vector组相比，UM-UC-3-EV_ELNAT1增加了小鼠足底肿瘤的淋巴管数量，而下调UBC9的表达导致EVs介导的ELNAT1诱导的淋巴管数量逐渐减少（Figure 9 G, H）。此外， UM-UC-3-EV_ELNAT1+si-UBC9#1组的LN生成时间长于UM-UC-3-EV_ELNAT1组（Figure 9 I）。综上所述，这些结果表明UBC9诱导的SUMOylation抑制EVs介导的ELNAT1诱导的BCa淋巴管生成和LN转移。

Figure 9阻断SUMOylation抑制EVs介导的ELNAT1诱导的淋巴结转移

10. EVs介导的ELNAT1与BCa淋巴结转移相关

确定EVs介导的ELNAT1在BCa淋巴结转移中的临床意义十分重要。首先，作者发现来自BCa患者的尿中EVs与配对BCa组织的ELNAT1表达呈正相关，这意味着EVs介导的ELNAT1是BCa中ELNAT1调控的重要参与者（Figure 10 A）。同时，BCa患者的尿中EV介导的ELNAT1过表达与BCa的淋巴结转移呈正相关（Figure 10 B）。EV介导的ELNAT1表达较高的BCa患者总生存期（OS）和无病生存期（DFS）率较短（Figure 10 C-D）。ROC分析显示尿液中EV介导的ELNAT1可有效区分BCa患者与健康志愿者 （Figure 10 E）。与尿液细胞学和FISH检查结果相比，尿液中EVs介导的ELNAT1诊断BCa-LN转移的准确性很高（Figure 10 F）。BCa患者血清中EVs介导的ELNAT1表达水平高于健康对照组（Figure 10 G）。与无淋巴结转移的BCa患者血清相比，伴有淋巴结转移的BCa患者血清中EVs介导的ELNAT1表达上调（Figure 10 H）。

Figure 10 EVs介导的ELNAT1与BCa淋巴结转移相关

结论：EVs介导的ELNAT1促进了BCa的淋巴管生成和淋巴结转移。充分阐明EVs介导的ELNAT1激活hnRNPA1/UBC9/ SOX18轴诱导BCa淋巴结转移的精确机制，不仅将增加我们对EVs介导的淋巴结转移的认识，也将有助于开发一种治疗BCa的有效策略。