m6A阅读器YTHDC2通过抑制SLC7A11依赖的抗氧化功能来抑制肺腺癌的发生

m⁶A RNA甲基化是mRNA转录后最常见的内部甲基化。这是一个由m⁶A WER系统控制的可逆过程，由书写器(W)、擦除器(E)和阅读器(R)组成，而m⁶A甲基化的最终结果取决于特异性阅读器的识别并结合。目前研究发现抑制肺腺癌(LUAD)与m6A阅读器YTHDC2相关。该研究2021年1月发表在《Redox biology》，IF：11.799的期刊上。

技术路线：

主要结果如下：

1. YTHDC2表达在LUAD中被抑制，且与临床预后差相关

为了验证m⁶A阅读器在肺癌的表达，作者通过GEPIA数据库分析了LUAD中已知的阅读器，包括YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、HNRNPA2B1、HNRNPC/G、eIF3A、FMR1和IGF2BP1/2。如图1A和B显示，与正常肺相比，LUAD 中YTHDC2、IGF2BP2表达下调，而结合Oncomine数据库和Kaplan-Meier图谱进一步分析，发现较低的YTHDC2与LUAD患者较差的总生存率相关(图1D)，这证实了YTHDC2与LUAD存在负相关的关系。

接着作者为了进一步证明YTHDC2与LUAD的关系，与相邻的癌旁组织相比，在LUAD肿瘤中观察到YTHDC2 mRNA和蛋白的显著下调(图1E-G)，组织芯片检测(TMA)评估cohort #1中YTHDC2的表达，结果显示51% (98/192) LUAD患者的YTHDC2表达下调(图1H、I)。值得注意的是，YTHDC2表达下调与更大的肿瘤直径和更晚期的分期相关(图1J、K)。表明抑制YTHDC2可促进LUAD的肿瘤进展。

图1 YTHDC2表达在LUAD中被抑制，且与临床预后差相关

2. 过表达YTHDC2抑制细胞活力和肿瘤发生

为了探索YTHDC2在体内的m⁶A解读器功能，作者构建AAV5表达系统(KPY^WT、KPY^ΔYTH和对照KPE)(图2A)。与KPE小鼠感染25周后的肿瘤相比，KPY^WT和KPY^ΔYTH小鼠的肿瘤证实了YTHDC2持续上调(图2B)，这表明AAV5表达系统具有持久的效率。虽然YTHDC2不能阻止肿瘤的发生，但肿瘤发生时间延迟，肿瘤负荷明显受到抑制，KPY^WT小鼠的生存时间比KPE小鼠和KPY^ΔYTH小鼠更长(图2C-F)。

作者进一步研究YTHDC2是否是存在人类LUAD细胞中的一种肿瘤抑制因子。IB检测证实了YTHDC2的过表达和敲除效率(图2G和S2A)。然而在H1299细胞中过表达YTHDC2^WT后，肿瘤3D球体的数量和大小以及异种移植瘤的生长下降，但在过表达YTHDC2^ΔYTH时没有观察到这些现象(图2 H-K)。相比之下，敲除H1975细胞中的YTHDC2增加了小鼠的球体形成和异种移植瘤的生长(图S2B-E)。值得注意的是，当使用YTHDC2^{sg2−resistant (res)}重组YTHDC2表达时，YTHDC2^sg2在肿瘤发生中的阳性作用得到了恢复(图S2B-E)。因此，YTHDC2通过其m6A阅读域在LUAD中发挥肿瘤抑制功能。

图2 过表达YTHDC2抑制细胞活力和肿瘤发生

图S2    敲除YTHDC2促进细胞活力和肿瘤发生

3. YTHDC2抑制LUAD的胱氨酸摄取和下游抗氧化程序

为了研究YTHDC2对代谢物的影响，作者对YTHDC2低表达和高表达的LUAD标本(分别称为YTHDC2^low和YTHDC2^high)进行代谢组学分析(n = 20/组)。如图3A显示，GSH代谢在KEGG通路中排名前20。在显著改变的代谢产物中，与YTHDC2^high的肿瘤相比，YTHDC2^low的肿瘤中胱氨酸含量增加了3.975倍(图3B)。此外，在cohort #1 (n = 100)中，YTHDC2和胞内胱氨酸呈负相关(图3C)。这些数据表明YTHDC2减少了细胞内的胱氨酸。

L-14c-胱氨酸摄取试验结果显示，YTHDC2通过其YTH域抑制了H1299细胞产生的异种移植物、小鼠形成的LUAD和患者来源的LUAD细胞的胱氨酸摄取(图3D-F)。图3H证明了系统Xc功能受损与GSH水平降低相关。NAC和GSH给药后，KPY^WT小鼠的肿瘤负荷明显高于给药对照小鼠，且水平与KPE小鼠相似(图3H、I)。与KPE小鼠相比，GSH和NAC给药仅导致KPY^WT小鼠肿瘤中GSH/GSSG比值显著增加。NAC和GSH的补充降低了KPY^WT小鼠的脂质过氧化并缩短了存活时间(图3K、L)。

图3 YTHDC2抑制LUAD的胱氨酸摄取和下游抗氧化程序

4. YTHDC2抑制依赖于SLC7A11的胱氨酸摄取

Xc^-系统是一个胱氨酸/谷氨酸逆向转运蛋白，捕获细胞外的胱氨酸，用于谷胱甘肽的合成，以交换谷氨酸的释放。在图3中，被抑制的Xc^-系统功能与YTHDC2受损的胱氨酸摄取有关，然而YTHDC2如何调节Xc^-系统依然未知。文献报道催化亚基SLC7A11在维持Xc^-系统活性方面起着重要作用。作者通过IB 和RT-qPCR发现，SLC7A11蛋白和mRNA水平均受YTHDC2负调控(图4A、B)。在小鼠中，与KPE和KPY^ΔYTH小鼠相比，KPY^WT小鼠的肿瘤中SLC7A11表达下调(图4C、D)。这证明YTH结构域是YTHDC2抑制SLC7A11表达的前提。

随后，作者研究了YTHDC2是否通过SLC7A11抑制胱氨酸摄取。当YTHDC2在H1299细胞中过表达时，并过表达SLC7A11完全恢复了受损的胱氨酸摄取(图4E-G)。ATF4是SLC7A11转录的关键转录因子，ATF4在H1299细胞中上调SLC7A11(图4H、I)。过表达YTHDC2仍然拮抗ATF4的作用(图4H-J)。因此，YTHDC2损害依赖于SLC7A11的胱氨酸摄取。结合临床分析，YTHDC2表达下调，而SLC7A11表达上调(图4K、L)，并且它们在肿瘤中呈负相关(图4M)。

图4 YTHDC2抑制依赖于SLC7A11的胱氨酸摄取

5. YTHDC2以m⁶A依赖的方式使SLC7A11 mRNA不稳定

作者为研究YTHDC2是否在转录被阻断后调控SLC7A11 mRNA的稳定性，通过泛转录抑制剂ActD处理H1299和H1975细胞，发现YTH结构域对于YTHDC2缩短H1299细胞中SLC7A11 mRNA的半衰期至关重要(图5A)。在H1975细胞中，CRISPR/Cas9技术使YTHDC2功能丧失，然后YTHDC2重构，进一步证实YTHDC2加速了SLC7A11 mRNA的衰变(图5B)。EXOSC10是一种外切酶，负责3’-5’外切酶活性。EXOSC10的缺失，减弱了YTHDC2缩短SLC7A11 mRNA半衰期的作用(图5C、D)。在药理学水平上，用两种泛-RNase抑制剂DEPC和RNasin治疗H1299细胞，也阻断了YTHDC2的功能(图5D)。

YTHDC2调节SLC7A11 mRNA的稳定性(图5A-D)，而控制RNA衰减是m⁶A甲基化的重要功能之一。作者先验证METTL3刺激m⁶A的能力(图5E、F)。在H1975细胞中敲降METTL3延长了SLC7A11 mRNA的半衰期，而在H1299细胞中过表达METTL3则加速了SLC7A11 mRNA的降解(图5G)。此外，H1299细胞中降低METTL3表达阻断了YTHDC2，从而减缓SLC7A11 mRNA的衰减，刺激胱氨酸摄取并减弱脂质活性氧(ROS)的生成(图5H-J)，这表明YTHDC2在LUAD细胞中的作用是依赖m⁶A。

图5 YTHDC2以m⁶A依赖的方式使SLC7A11 mRNA不稳定

6. YTHDC2倾向于相互作用并使m⁶A甲基化的SLC7A11 mRNA不稳定

为了揭示SLC7A11 mRNA中潜在的m⁶A甲基化位点，在H1975细胞中METTL3敲除前后分别进行了MeRIP-seq研究。在H1975细胞中，无论是否敲除METTL3, GGAC motif都高度富集于m⁶A位点(图6A)。m⁶A峰在mRNA停止密码子附近的3’非翻译区(3’UTR)尤为丰富(图6B)。为了进一步证实SLC7A11 mRNA的m⁶A依赖性修饰，我们进行MeRIP-qPCR。在H1975细胞中，敲除METTL3后，SLC7A11 mRNA中的m⁶A修饰明显减少，特别是在假定的m⁶A位点周围。相反，当METTL3在H1299细胞中过表达时，观察到相反的结果(图6C)。

作者进行了PAR-CLIP实验，以评估SLC7A11 mRNA-YTHDC2相互作用是否依赖于m⁶A甲基化。结果表明，在H1299细胞中，通过过表达METTL3来提高m⁶A的甲基化水平，促进YTHDC2与SLC7A11 mRNA的结合(图6D)。无论METTL3是否过表达，YTH结构域的缺失都阻断了SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用(图6D)。作者通过SLC7A11 3’-UTR探针进行RNA-pull down实验，发现YTHDC2^WT，优先结合于含有m⁶A的SLC7A11 mRNA的3'UTR，而不是含有未甲基化腺苷的mRNA(图6E)。此外，YTHDC2倾向于结合m⁶A共识基元GGAC (图6E)。通过在H1299和H1975细胞中进行METTL3的功能增加和丢失实验，发现细胞内SLC7A11 mRNA-YTHDC2的相互作用是由m⁶A水平决定的(图6F和G)。这些数据表明YTHDC2优先与m⁶A甲基化的SLC7A11 mRNA结合。

作者构建了 (WT) SLC7A113’-UTR和突变型(Mut) 3’-UTR两种质粒(图6H)。结果表明，只有过表达YTHDC2^WT降低SLC7A11 mRNA在H1299细胞中的稳定性，敲除YTHDC2可以提高SLC7A11 mRNA在H1975细胞中的稳定性。然而，与WT 3’-UTR相比，Mut报告基因的这些作用减弱(图6I和J)。在检测外源性F-Luc-SLC7A11融合mRNA的RNA稳定性后，得到了类似的结果(图6K-M)。总的来说，3’-UTR上的m6A位点对于YTHDC2使SLC7A11 mRNA不稳定至关重要。

图6 YTHDC2倾向于相互作用并使m⁶A甲基化的SLC7A11 mRNA不稳定

7. 抑制YTHDC2对XC^-系统靶向治疗敏感，并与LUAD进展相关

为了评估YTHDC2抑制在LUAD中的重要性，从cohort #1随机抽取20例YTHDC2^low LUAD，其中50%属于腺泡型(图7A)。在cohort #2中，与相邻组织相比，肿瘤中YTHDC2表达下调，62%(62/100)的腺泡组织被归类为YTHDC2^low(图7B、C)。与无这种表达模式的腺泡性LUAD患者相比，YTHDC2^low的患者总生存期要短得多(图7D)，进一步表明YTHDC2抑制可能对腺泡性LUAD的肿瘤进展尤为重要。另外，相对于癌旁组织，肿瘤中腺泡LUAD组织中SLC7A11 mRNA和蛋白水平表达量都比较高(图7E、F)。

来自4个不同腺泡性LUAD患者的PDX模型被给予XC^-系统抑制剂erastin (PKE)和多激酶抑制剂索拉非尼(sorafenib)。与DMSO治疗的对照组相比，PKE和sorafenib给药时观察到显著的肿瘤消退(图7G-J)。此外，PKE和sorafenib给药小鼠也导致肿瘤中MDA和4-HNE的显著增加(图7K和L)，提示诱导的脂质过氧化可能是抑制腺泡LUADs肿瘤发生的结果。

图7M显示，与癌旁组织相比，癌症组织中MDA和YTHDC2表达量都降低，而SLC7A11 mRNA和蛋白水平都升高，证明在LUAD中抑制YTHDC2可通过SLC7A11表达上调阻止脂质过氧化。同样地，MDA和YTHDC2与癌症期数呈负相关，而SLC7A11与分期呈正相关(图7N)，说明SLC7A11的升高可能是抑制YTHDC2促进LUAD进展的关键。

图7 抑制YTHDC2对XC^-系统靶向治疗敏感，并与LUAD进展相关

结论：

本研究强调了m⁶A阅读器YTHDC2在LUAD中的重要性。XC⁻系统活性可能通过抑制YTHDC2来诱导促进肿瘤发生。此外，基于YTHDC2表达的分子模型可能有助于预测LUAD的预后。抑制剂靶向XC⁻系统可能有助于治疗预后不良的LUAD患者。因此，本研究对LUAD的肿瘤发生、分子分型和药物敏感性提供了有价值的见解。

研究模型通路

参考文献：

Ma, L., Chen, T., Zhang, X., Miao, Y., Tian, X., Yu, K., Xu, X., Niu, Y., Guo, S., Zhang, C., Qiu, S., Qiao, Y., Fang, W., Du, L., Yu, Y., Wang, J. (2021). The m⁶A reader YTHDC2 inhibits lung adenocarcinoma tumorigenesis by suppressing SLC7A11-dependent antioxidant function. Redox Biol., 38:101801. doi:10.1016/j.redox.2020.101801