癌症免疫治疗新贡献——单胺氧化酶A
靶向肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)是一种很有前途的策略，可以改变免疫抑制肿瘤微环境，改善肿瘤免疫治疗。单胺氧化酶A (MAO-A)是一种因其在大脑中的功能而著名的酶，小分子MAO抑制剂(MAOIs)用于临床治疗神经系统疾病。这里作者发现MAO-A诱导人和小鼠的TAMs进而可用于癌症的免疫治疗。该文2021年6月发表于《nature communications》IF：14.919期刊上。
技术路线：
主要实验结果：
1、MAO-A缺陷小鼠显示与TAM极化改变相关的肿瘤生长减少
将同基因B16-OVA黑色素瘤接种给C57BL/6J小鼠，分离出TAM并评估TAM基因表达谱。除了参与调节巨噬细胞免疫应答的经典基因的变化，还观察到一个Maoa基因在TAMs中的上调表达（图1a），这表明MAO-A可能参与了TAM活性的调节。首先构建MAO-A缺陷的小鼠，然后接种B16-OVA黑色素瘤细胞，结果显示，与野生型相比，MAO-A缺陷小鼠的肿瘤生长被显著抑制（图1b-d）。流式检测TAM的标志物表达，结果显示MAO-A缺陷小鼠表现出更少的免疫抑制表型，即免疫抑制标志物CD206表达显著下调，而免疫刺激分子CD9，CD86和MHC class II I-Ab的表达上调（图1e-h）。进一步的分析显示，来自Maoa KO小鼠的TAMs免疫抑制相关基因表达水平降低，如Mrc1，Chi3l3和Arg1（图1i），而免疫刺激相关基因表达上调，如Il6，Tnfα和Ccl2（图1j）。作者对野生型和Maoa KO小鼠进行单细胞测序，分析了肿瘤浸润免疫细胞（TIIs）。结果显示TIIs由六种细胞组成，即TAM/Mono, T cell, NK cell, B cell, DC and pDC（图1k）。两种小鼠细胞类别分布相似。而TAM/Mono亚群由5种细胞类别组成，即TAM_1, TAM_2, Mono_1, Mono_2 and Mono_3（图1k）。与Maoa KO小鼠的TAMs免疫表型减少一致，与野生型相比，其TAM亚群中TAM_1（Mrc1lowCd86high）比TAM_2（Mrc1 highCd86 low）的比例下降（图1l）。免疫相关基因表达表现出一致的趋势（图1m-n）。这些结果强烈表明MAO-A是参与调节TAM极化进而调控抗肿瘤免疫的。
图1 MAO-A缺陷小鼠显示与TAM极化改变相关的肿瘤生长减少
2、MAO-A直接调节TAM极化并影响TAM相关的T细胞抗肿瘤活性
为了确定MAO-A是否直接调节免疫细胞，进行一个骨髓（BM）转移实验，从Maoa WT或KO小鼠中获得的BM细胞被连续转移到BoyJ (CD45.1) WT受体小鼠中，然后该小鼠接受B16-OVA黑色素瘤细胞接种（图2a）。在本实验中，MAO-A缺乏的比较仅限于免疫细胞。结果显示免疫细胞中MAO-A缺陷导致肿瘤生长抑制（图2b-c），改变TAM极化（图2d-f），增强肿瘤浸润CD8+T细胞激活，表明MAO-A直接调节免疫细胞抗肿瘤活性，特别是TAM极化和T细胞抗肿瘤反应。
为了进一步研究MAO-A是否作为巨噬细胞自主因子直接调控TAM极化从而影响抗肿瘤免疫，进行了巨噬细胞过继转移肿瘤实验。从Maoa WT和KO小鼠中获取BM细胞，然后培养成骨髓源性巨噬细胞(bone marrow macrophages, BMDMs)。然后将这些Maoa WT或KO BMDMs与B16-OVA黑色素瘤细胞混合，皮下注射到BoyJ WT受体小鼠中建立实体肿瘤（图2g）。在本实验中，MAO-A缺乏的比较仅限于TAM细胞。在接受Maoa KO BMDMs小鼠中观察到肿瘤生长抑制（图2h-i），TAM免疫抑制markers下调（图2j），免疫刺激markers上调（图2k-l），以及增强肿瘤浸润CD8+T细胞激活（图2m）。综上所述，这些体内研究表明MAO-A作为一种直接调节TAM极化的自主因子，从而影响T细胞抗肿瘤反应性和影响肿瘤生长。
图2 MAO-A直接调节TAM极化并影响TAM相关的T细胞抗肿瘤活性
3、MAO-A促进巨噬细胞免疫抑制极化
为了研究MAO-A对巨噬细胞极化的调控，体外培养Maoa WT和KO BMDMs，并通过添加抗炎刺激（IL4和IL-13）使这些巨噬细胞向免疫抑制表型极化（图3a）。观察到，在M - CSF诱导的巨噬细胞分化过程中，Maoa mRNA的表达在Maoa野生型BMDMs中有明显的诱导作用，Maoa在成熟的BMDMs中表达趋于稳定，并维持IL-4/ IL -13诱导的免疫抑制极化（图3b-c）。Maoa KO BMDMs中MAO-A表达未检测到，证实了其MAO-A缺失基因型（图3b, d）。与野生型巨噬细胞相比，在IL-4/IL-13刺激下，Maoa KO巨噬细胞表现出更低的免疫抑制表型，这在其免疫抑制标记物的表达减少中得到了证明（图3e-g）。在巨噬细胞/T细胞共培养试验中（图3h），IL-4/ IL -13极化的Maoa KO巨噬细胞在抗CD3 /CD28刺激下，与免疫抑制表型的减弱一致，其对野生型CD8+ T细胞的抑制作用减弱（图3i-k）。
为了验证MAO-A缺乏是否直接有助于减轻Maoa KO巨噬细胞的免疫抑制极化，进行拯救实验。构建MIG-Maoa逆转录病毒载体，利用该载体转导Maoa KO BMDMs，并在这些巨噬细胞中实现了MAO-A的过表达（图3l-n）。MAO-A过表达显著加剧了IL-4/ IL-13刺激的Maoa KO BMDMs的免疫抑制表型（图3o-p）。综上所述，这些结果表明，MAO-A作为一种自主因子，在抗炎刺激下促进巨噬细胞免疫抑制极化。
图3 MAO-A促进巨噬细胞免疫抑制极化
4、MAO-A通过ROS上调促进巨噬细胞免疫抑制极化
接下来，研究调控MAO-A促进巨噬细胞免疫抑制极化的分子机制。据报道，细胞内活性氧(ROS；氧化应激)会引起巨噬细胞的免疫抑制特征。MAO-A催化单胺的氧化脱氨，从而产生过氧化氢(H2O2)作为副产物，可以增加细胞内ROS水平。因此，推测MAO-A可能通过上调TAM中的ROS水平，促进TME中TAM的免疫抑制极化（图4a）。为了验证这一假设，测量了从携带B16-OVA肿瘤的Maoa WT和KO小鼠中分离的TAMs中的ROS水平，并检测到Maoa KO TAMs中ROS水平显著降低（图4b-c）。对离体培养的Maoa野生型和KO BMMDs中ROS水平的测定也显示，在IL-4/IL-13刺激或不刺激下，Maoa KO BMMDs中ROS水平降低，与体内TAM结果一致（图4d）。向IL-4/ IL-13刺激的Maoa WT和KO BMDMs补充H2O2可将其细胞内ROS水平提高到相似水平，并消除它们在免疫抑制标记物和特征基因表达的差异（图4e-g）。另一方面，补充酪氨酸(MAO-A的底物)可增加ROS水平，并上调免疫抑制基因在Maoa WT BMDMs中的表达，但在Maoa KO BMDMs中不上调（图4h-j）。综上所述，这些数据表明MAO-A通过调节巨噬细胞内ROS水平来调节巨噬细胞的免疫抑制极化。
JAK-Stat6信号通路在介导IL-4/IL-13诱导TME中TAMs免疫抑制极化过程中起关键作用。IL-4/IL-13刺激后，JAK磷酸化，随后Stat6磷酸化，磷酸化后的Stat6二聚并迁移至细胞核，然后与IL-4/IL-13相应基因，包括那些参与巨噬细胞免疫响应功能的基因的启动子结合。据报道ROS可以促进JAK和Stat6磷酸化。因此，推测MAO-A可能通过上调ROS水平影响巨噬细胞极化，从而使JAK-Stat6信号通路敏感。事实上，直接分析从B16-OVA荷瘤Maoa WT和Maoa KO小鼠中分离的TAMs证实，与野生型TAMs相比，MAO - A缺陷的TAMs显示Stat6激活降低（图4k-l）。进一步分析IL-4/ IL-13诱导的JAK-Stat6信号通路，与在Maoa WT BMDMs中相比，在Maoa KO BMDMs中JAK-Stat6信号显著下降，补充H2O2可使其JAK-Stat6信号达到与WT类似水平（图4m）。这些数据表明MAO-A通过ROS致敏的JAK-Stat6通路激活促进巨噬细胞免疫抑制极化。
总之，这些体内外数据支持MAO-A促进TME中免疫抑制极化，通过上调TAM细胞内ROS水平，从而提高IL-4/ IL -13诱导的JAK-Stat6信号通路。
图4 MAO-A通过ROS上调促进巨噬细胞免疫抑制极化
5、MAO-A阻断肿瘤免疫治疗-小鼠肿瘤模型研究
MAO-A作为TAM免疫抑制极化的关键调控因子的鉴定使得MAO-A成为癌症免疫治疗的一个有前途的药物靶点。由于已知的MAO-A在大脑中的功能，小分子MAOIs已经被开发和临床用于治疗各种神经系统疾病，使其成为一种高度可行和有吸引力的方法来重新利用这些已建立的MAOI药物用于癌症免疫治疗。在体外IL-4/IL-13 诱导WT BMDM极化培养中（图5a），添加多种MAOIs可以有效降低BMDM中的ROS水平，抑制它们的免疫抑制极化和基因（图5b-e）。值得注意的是，图5a测试的MAOIs包括苯乙肼、克劳吉林、莫氯比胺和吡吲哚，涵盖了已建立的MAOIs的主要类别，这些类别是基于它们对MAO-A是非选择性的还是选择性的，以及它们的作用是否可逆。在这些MAOIs中，苯乙肼 (phenelzine商品名:Nardil)在美国临床可用。在接下来的研究中，以苯乙肼为代表，使用两种同基因小鼠肿瘤模型:B16-OVA黑色素瘤模型和MC38结肠癌模型，研究MAOIs用于癌症免疫治疗的可能性。值得注意的是，苯乙肼是一种非选择性不可逆的MAOI，可抑制MAO-A及其同工酶MAO-B。然而，由于小鼠巨噬细胞主要表达MAO-A，而不是MAO-B，因此在这些肿瘤模型中，苯乙肼治疗主要通过抑制MAO-A来调节TAM重编程。
首先，研究苯乙肼在B16-OVA肿瘤预防模型中的治疗潜力（图5f）。苯乙肼能有效抑制B6 WT小鼠B16-OVA肿瘤的生长（图5g-h）。当使用氯膦酸脂质体处理敲除小鼠TAM时，小鼠没有观察到肿瘤生长的差异（图5g-h），这表明苯乙肼通过调节TAMs来抑制肿瘤生长。相应地，从苯乙肼处理的小鼠中分离出的TAMs显示出较低的免疫抑制表型，表现为其免疫抑制标记物和特征基因的表达降低，而免疫刺激标志物增加（图5i-j）。在MC38肿瘤中得出类似结论。
接下来，评估苯乙肼联合治疗的潜力，特别是联合其他ICB治疗，如PD-1/PD-L1阻断治疗（图5k）。尽管大多数ICB疗法针对的是CD8+ T细胞，但这些细胞实际上受到TME中的TAMs的密切调控，使靶向TAMs成为免疫治疗的另一种潜在途径。在B16-OVA和MC38肿瘤模型中，苯乙肼治疗显著抑制了预先建立的实体肿瘤的进展，其水平与抗PD -1治疗相当，重要的是，苯乙肼与抗PD-1联合治疗具有协同抑制肿瘤的疗效（图5l-o）。总的来说，这些小鼠肿瘤模型研究为MAOIs通过靶向TAM重编程从而增强抗肿瘤T细胞反应的癌症免疫治疗潜力提供了证据。
图5 MAO-A阻断肿瘤免疫治疗-小鼠肿瘤模型研究
6、MAO-A阻断肿瘤免疫治疗-人类TAM和临床数据相关性研究
为了探索MAO-A阻断治疗的翻译潜力，首先研究了MAO-A对人巨噬细胞极化的调控。分析体外培养的免疫刺激M1样和免疫抑制M2样人单核细胞源性巨噬细胞的基因表达特征。有趣的是，在所有检测的免疫检查点、免疫刺激和免疫抑制基因中，MAOA是M2样单核来源巨噬细胞（MDMs）中表达水平最高的基因（图6a），提示MAO-A可能在促进人巨噬细胞免疫抑制极化中发挥作用。MDM培养的时间过程分析证实了巨噬细胞分化过程中MAO-A基因和蛋白表达上调，并在IL-4/IL-13诱导的免疫抑制极化后进一步上调（图6b-d）。用苯乙肼阻断MAO-A可显著抑制IL-4/IL-13诱导的MDMs免疫抑制极化（图6e-g）。综上所述，这些体外数据表明MAO-A在人巨噬细胞中高表达，特别是在其免疫抑制极化期间，并且MAO-A阻断具有重新编程人巨噬细胞极化的潜力。
为了直接评价MAOIs是否能在体内重编程人TAM的极化，建立了人肿瘤/TAM异种移植NSG小鼠模型。A375人黑色素瘤细胞与健康供者外周血单个核细胞(PBMCs)分离的单核细胞混合，注射到NSG小鼠中形成实体瘤，接种后给予或不给予苯乙肼治疗（图6h）。苯乙肼能有效抑制人TAMs的免疫抑制极化（图6i-j）。
接下来，研究了MAOI诱导的人TAM重编程是否会影响人T细胞的抗肿瘤活性，使用3D人肿瘤/TAM/ T细胞类器官培养。NY-ESO-1是一种公认的肿瘤抗原，通常在多种人类肿瘤中表达，被选为模型肿瘤抗原。A375人黑素瘤细胞系设计为共表达NY-ESO-1及其匹配的MHC分子HLA-A2作为人肿瘤靶点（命名为A375-A2-ESO）。NY-ESO-1特异性人CD8+T细胞的构建是通过将Retro/ESO-TCR编码NY-ESO-1特异性TCR（命名为ESO-TCR）的逆转录病毒载体转导至健康供体外周血CD8+T细胞，将该细胞命名为ESO-T细胞，它表达ESO-TCRs，特异性靶向A375-A2-ESO肿瘤细胞，从而建立肿瘤特异性人CD8+ T细胞模型。将A375-A2-ESO人黑色素瘤细胞、ESO-T细胞和IL-4/IL-13极化的MDMs以2:2:1的比例混合，放置在模拟TME的3D肿瘤类器官培养物中（图6k）。IL-4/IL-13极化MDMs有效抑制ESO - T细胞介导的A375-A2-ESO肿瘤细胞的杀伤；在MDM极化过程中，苯乙肼的治疗在很大程度上缓解了这种免疫抑制作用（图6l）。因此，与苯乙肼处理的MDMs共培养的ESO-T细胞相比，与非苯肼处理的MDMs共培养的ESO-T细胞显示了T细胞活化的增强（图6m）。总的来说，这些数据表明MAOI诱导的人类TAM重编程具有改善抗肿瘤T细胞反应的潜力。此外，人和小鼠的TAM都高表达MAOA基因（图6n），证实MAO-A可作为人类TAMs的有效药物靶点。
最后，分析了MAOA基因表达水平与几种癌症病人临床预后的关系，结果显示瘤内MAOA基因与卵巢癌，淋巴癌和乳腺癌患者的临床总生存率呈现负相关关系（图6o-q）。此外，黑色素瘤患者肿瘤内高水平的MAOA表达很大程度上抵消了PD-1治疗提供的生存好处，提示MAO-A阻断治疗与PD-1/PD-L1阻断治疗联合可能通过调节TAM极化，从而改变免疫抑制TME，提高抗肿瘤免疫能力，提供协同治疗好处（图6r）。
综上所述，人类TAM和临床相关性研究证实了MAO-A作为人类TAM中一个有前途的药物靶点，并支持了MAO-A通过靶向TAM重编程阻断癌症免疫治疗的翻译潜力。
图6 MAO-A阻断肿瘤免疫治疗-人类TAM和临床数据相关性研究
参考文献：
Wang Yu-Chen., Wang Xi., Yu Jiaji., Ma Feiyang., Li Zhe., Zhou Yang., Zeng Samuel., Ma Xiaoya., Li Yan-Ruide., Neal Adam., Huang Jie., To Angela., Clarke Nicole., Memarzadeh Sanaz., Pellegrini Matteo., Yang Lili.(2021). Targeting monoamine oxidase A-regulated tumor-associated macrophage polarization for cancer immunotherapy. Nat Commun, 12(1), 3530. doi:10.1038/s41467-021-23164-2