m6A阅读器YTHDC2通过抑制SLC7A11依赖性抗氧化功能抑制肺腺癌肿瘤发生

肺腺癌 (LUAD) 是最常见的非小细胞肺癌类型。然而，LUAD 肿瘤发生的潜在机制在很大程度上是未知的。N6-甲基腺苷 (m6A) RNA 甲基化在各种人类癌症中的关键作用，包括肺癌。今天来讲一篇关于m6A与肺癌的文章，题名为：The m 6 A reader YTHDC2 inhibits lung adenocarcinoma tumorigenesis by suppressing SLC7A11-dependent antioxidant function（IF=11.79）。

YTHDC2的抑制与LUAD中的肿瘤进展有关

为了评估m6A阅读器在肺癌中的表达谱，通过 GEPIA 数据库分析了已知的阅读器，包括 YTHDF1/2/3、YTHDC1/2、HNRNPA2B1、HNRNPC/G、eIF3A、FMR1 和 IGF2BP1/2。其中，与正常肺相比，LUAD 和 LUSC 中只有 YTHDC2 下调。然而，IGF2BP2 在 LUAD 和 LUSC 中差异表达。Oncomine 数据库还显示 YTHDC2 在 LUAD 中通常被下调。Kaplan-Meier 图的分析进一步表明，较低的 YTHDC2 与 LUAD 中较差的总体生存率相关。这些结果使我们研究了 YTHDC2 在 LUAD 中的作用。

患者肺癌组织样本中，与邻近的正常组织相比，在肿瘤中观察到YTHDC2 mRNA 和蛋白质的显着下调。类似地，与 BEAS-2B 细胞相比，已建立的 LUAD 细胞系中的 YTHDC2 减少。组织芯片分析表明 YTHDC2 在 51% (98/192) 的 LUAD 患者中下调。值得注意的是，YTHDC2 的下调与更大的肿瘤直径和更晚期的阶段有关。表明 YTHDC2 抑制促进了 LUAD 中的肿瘤进展。

YTHDC2 通过其 m 6 A 阅读域表现出抗肿瘤活性

为了在体内探索YTHDC2的 m 6 A 阅读器功能，在有或没有 m 6 A 识别 YTH 结构域的情况下实现了 YTHDC2 的肺过表达，并生成了基于 KP 和 GFP 标记的 KPY WT、KPY ΔYTH和对照 KPE 小鼠。除了强烈的 GFP 信号外，与感染后 25 周的 KPE 小鼠相比，YTHDC2 被证实在来自 KPY WT和 KPY ΔYTH小鼠的肿瘤中持续上调。，表明 AAV5 表达系统的持久效率。尽管YTHDC2无法阻止肺肿瘤发生，但肿瘤发生时间被延迟，压倒性的肺肿瘤负荷被显着抑制，KPY WT小鼠的存活时间比KPE小鼠和KPY ΔYTH小鼠长。

我们进一步研究了 YTHDC2 是否是人类 LUAD 细胞中的肿瘤抑制因子。选择 H1975 和 H1299 细胞是因为它们分别在测试的 LUAD 细胞系中表现出最高和最低的 YTHDC2 表达。IB 检测证实了 YTHDC2 的过表达和敲除效率。虽然在 H1299 细胞中YTHDC2 WT过表达后3D 球体的数量和大小以及异种移植物的肿瘤生长减少，但在 YTHDC2 ΔYTH过表达后未观察到这些影响。相比之下，敲除 H1975 细胞中的 YTHDC2 会增加小鼠的球体形成和异种移植物生长。值得注意的是，当使用 YTHDC2 sg2-抗性（res）重建 YTHDC2 表达时，YTHDC2-sg2 在肿瘤发生中的积极作用得以恢复。因此，YTHDC2 通过其 m 6 A 阅读域在 LUAD 中发挥肿瘤抑制功能。这些结果也解释了为什么 Ythdc2 在鼠肿瘤中的显着表达和 H1299 细胞中的 YTHDC2当突变体过表达时，没有改变转化表型。

YTHDC2 抑制胱氨酸摄取和下游抗氧化程序

通常在具有高致瘤特性的肿瘤中观察到代谢活性。为了研究 YTHDC2 对代谢物的影响，进行了代谢组学分析，比较了具有低和高 YTHDC2 表达（的LUAD 标本。GSH 代谢是确定的前 20 条 KEGG 途径之一。在显着改变的代谢物中，与 YTHDC2高肿瘤相比，在 YTHDC2低肿瘤中观察到胱氨酸增加了 3.975 倍。此外，观察到 YTHDC2 与细胞内胱氨酸之间呈负相关。这些数据表明 YTHDC2 减少细胞内胱氨酸。

为了验证 YTHDC2 是否降低了胱氨酸摄取，我们培养了具有高 (pHY#1-8) 或低 (pLY#1-8) YTHDC2 表达水平的原代患者来源的 LUAD 细胞。L- 14 C-胱氨酸摄取测定结果表明，YTHDC2 通过其 YTH 结构域抑制了 H1299 和 H1975 细胞产生的异种移植物、小鼠形成的 LUAD 和患者来源的 LUAD 细胞中的胱氨酸摄取。已显示CHAC1 mRNA 水平的上调表明胱氨酸摄取受损。事实上，观察到 YTHDC2 增加了CHAC1 mRNA 水平。胱氨酸-谷氨酸逆向转运蛋白系统 Xc -通过谷氨酸的反向转运导入胱氨酸。谷氨酸释放测定结果显示 YTHDC2 抑制谷氨酸释放。这些结果表明 YTHDC2 通过抑制系统 Xc - 来损害胱氨酸摄取。System Xc -对氧化还原平衡和新陈代谢至关重要，以及YTHDC2 的 YTH 结构域对 H1299 和 H1975 细胞中GSH/GSSG 和 NAD + /NADH 比率的改变，进一步表明 YTHDC2 可能损害系统 Xc -功能。

受损的系统 Xc -功能与 GSH 水平降低有关。来自患者来源的 LUAD 细胞和小鼠肿瘤的数据表明 YTHDC2 确实降低了 GSH。为了研究下游的胱氨酸抗氧化剂是否补偿了 YTHDC2 的抗肿瘤作用，给小鼠注射了 GSH 和 NAC，一种半胱氨酸前体。给予 NAC 和 GSH 的KPY WT小鼠肺中的肿瘤负荷显着高于载体治疗的对照小鼠，并且水平与 KPE 小鼠相似。有趣的是，与KPE 小鼠相比，GSH 和 NAC 给药仅导致 KPY WT小鼠肿瘤中 GSH/GSSG 比率的显着增加。该结果的一个潜在原因是 YTHDC2 损害系统 Xc -，我们提出系统 Xc -功能的损害可能对促进 GSH 及其除胱氨酸以外的原料，如半胱氨酸或其前体进入细胞。

正如之前的研究中所报道的，缺乏 GSH 导致脂质过氧化增加。因此，荧光探针（C11-BODIPY 581/591）用于测量小鼠 LUAD 中的氧化脂质。此外，作为脂质过氧化产物的 4-HNE 和 MDA 水平在 KPY WT的肿瘤中增加，但在 KPY ΔYTH 中没有增加小鼠与 KPE 小鼠相比。值得注意的是，在 KPY WT小鼠中，NAC 和 GSH 补充剂可减少脂质过氧化并缩短存活时间。总体而言，这些结果表明YTHDC2的 m 6 A 读取功能对于减少胱氨酸下游抗氧化程序至关重要

YTHDC2 抑制 SLC7A11 表达

虽然抑制系统 Xc -功能与 YTHDC2 受损的胱氨酸摄取有关，YTHDC2 如何调节系统 Xc -仍不清楚。SLC7A11，催化亚基，在维持系统 Xc -活性方面发挥着重要作用。使用 UALCAN 数据库，我们发现与正常肺相比，LUAD 中的 SLC7A11 上调。此外，较高的 SLC7A11 导致 LUAD 患者的总生存期较短。值得注意的是，YTHDC2 与 LUAD 中的 SLC7A11 呈负相关。因此，SLC7A11 可能与 YTHDC2 的功能相反，以维持胱氨酸摄取。

接下来，研究了 YTHDC2 是否调节 SLC7A11。在 H1299 和 H1975 细胞中，SLC7A11 的蛋白质和 mRNA 水平都受到 YTHDC2 的负调控。在小鼠中，与来自 KPE 和 KPY ΔYTH小鼠的肿瘤相比，来自 KPY WT小鼠的肿瘤中的 Slc7a11 下调。此外，YTH 结构域是 YTHDC2 抑制 SLC7A11 表达的先决条件。

随后，我们研究了 YTHDC2 是否通过 SLC7A11 抑制胱氨酸摄取。当 YTHDC2 在 H1299 细胞中过表达时，异位表达 SLC7A11 完全恢复了受损的胱氨酸摄取。相反，YTHDC2 缺失诱导的胱氨酸摄取被靶向 H1975 细胞中 SLC7A11 的 shRNA 逆转。ATF4 和 NRF2 是SLC7A11转录的两个关键转录因子。与 ATF4 不同，NRF2 无法上调 H1299 细胞中的 SLC7A11，这可能是由于 LUAD 单元格上下文特定的影响。值得注意的是，过表达 YTHDC2 仍然拮抗 ATF4 的作用。因此，YTHDC2 损害依赖于 SLC7A11 的胱氨酸摄取。

还研究了换着样本中 YTHDC2 和 SLC7A11 的临床相关性。与邻近组织相比，YTHDC2 在肿瘤中被下调，而 SLC7A11 在肿瘤中被上调。此外，它们在肿瘤中呈负相关。

YTHDC2 加速SLC7A1 1 mRNA 衰减

进一步研究了通过 YTHDC2 调节 SLC7A11 表达的机制。因为 SLC7A11 的 mRNA 和蛋白质水平都受到 YTHDC2 的负调控，我们想确定 SLC7A11 的 mRNA 和蛋白质水平是否都被 YTHDC2 抑制。为了解决这个问题，首先研究了 YTHDC2 是否调节SLC7A1 1 mRNA。当 YTHDC2 在 H1299 细胞中过表达时，YTH 结构域在抑制SLC7A11启动子活性方面没有作用。敲除 YTHDC2 然后在 H1975 细胞中重建其表达也表明 YTHDC2 调节SLC7A11转录。然后，我们用泛转录抑制剂 ActD 处理 H1299 和 H1975 细胞，以检查 YTHDC2 是否在转录被阻断后调节SLC7A1 1 mRNA 的稳定性，发现 YTH 结构域对于 YTHDC2 缩短SLC7A1 1 mRNA的半衰期是必不可少的H1299 细胞。通过 CRISPR/Cas9 技术丧失 YTHDC2 功能，随后在 H1975 细胞中重建 YTHDC2 进一步证实 YTHDC2 加速SLC7A1 1 mRNA 衰减。。删除 EXOSC10 而不是 XRN2，减弱了 YTHDC2 对缩短SLC7A1 1 mRNA 半衰期的影响。，表明 YTHDC2 促进 3'-5' SLC7A1 1 mRNA 降解。在药理学水平上，用 DEPC 和 RNasin 这两种泛 RNase 抑制剂处理 H1299 细胞也阻断了 YTHDC2 的功能。这些发现确立了 YTHDC2 在破坏LUAD 细胞中SLC7A1 1 mRNA 的稳定性中的作用。

YTHDC2 调节SLC7A1 1 mRNA 稳定性，控制 RNA 衰变是 m 6 A 甲基化的重要功能之一。。YTHDC2抑制SLC7A11的功能是否依赖于m 6 A甲基化仍然未知。在三个主要作者中，即 METTL3、METTL14 和 WTAP，与 H1299 细胞相比，仅发现较高的 METTL3 表达水平与 H1975 细胞中较高的整体 m 6 A 甲基化水平相关。METTL3增加H1299和H1975细胞中m 6A。在 H1975 细胞中敲低 METTL3 延长了SLC7A1 1 mRNA的半衰期，而在 H1299 细胞中过表达 METTL3 加速了SLC7A1 1 mRNA 降解。此外，H1299 细胞中降低的 METTL3 表达会阻止 YTHDC2 加速SLC7A1 1 mRNA 衰变，损害胱氨酸摄取并刺激脂质活性氧 (ROS) 的产生。表明 YTHDC2 在 LUAD 细胞中的作用是 m 6 A 依赖性的。

SLC7A1 1 mRNA 被 m 6 A 甲基化

为了揭示SLC7A1 1 mRNA 中潜在的 m 6 A 甲基化位点，在H1975细胞中 METTL3 敲低之前和之后进行了 MeRIP-seq。GGAC 基序在 H1975 细胞的m6A 位点高度富集，无论是否敲除METTL3。m6A 峰在靠近 mRNA 终止密码子的 3' 非翻译区 (3'UTR) 中尤为丰富。MeRIP-seq 揭示了一个推定的m6A 基序位于 3'UTR。该位点周围的 m 6 A 富集与 m 6 A 甲基化水平相关。为了进一步确认SLC7A1 1 mRNA的 m6A 依赖性修饰，进行了 MeRIP-qPCR。在H1975细胞中敲除 METTL3 后，SLC7A1 1 mRNA 中的m 6 A 修饰在推定的 m 6 A 位点周围显着减少。相反，当 METTL3 在 H1299 细胞中过表达时，观察到相反的结果。因此，我们提供了证据表明SLC7A1 1 mRNA 可以在 LUAD 细胞中被 m 6 A 甲基化。

尽管 YTHDC2 用作 m6A 阅读器，但YTHDC2是否优先结合并识别 m 6 A 甲基化的SLC7A1 1 mRNA 尚不清楚。首先进行了评估SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用。结果表明，通过在 H1299 细胞中过表达 METTL3来增加 m 6 A 甲基化水平促进了 YTHDC2 与SLC7A1 1 mRNA 的结合。相比之下，一旦 METTL3 在 H1975 细胞中被敲除，SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用就被显着抑制。无论 METTL3 是过度表达还是被敲低，YTH 结构域的缺失都会阻止SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用。接下来，我们使用合成的部分SLC7A11 3'UTR 探针进行了体外 RNA 下拉测定，并将它们与来自表达 HA 标记的 YTHDC2 WT和 YTHDC2 ΔYTH 的H1299 细胞的裂解物一起孵育。YTHDC2 WT，但不是 YTHDC2 ΔYTH，与含有未甲基化腺苷的SLC7A1 1 mRNA的 3'UTR相比，更优先结合含有 m 6 A 的mRNA。此外，YTHDC2 易于结合 m 6 A 共有基序 GGAC，这与位于推定的 m 6 A 位点内的相同，因为当 GGAC 被取代时，观察到SLC7A11 3'UTR-YTHDC2 相互作用显着减少一个随机的 CCAG 主题。最后，进行了 RIP-qPCR 测定以评估 m6 A 甲基化是否调节细胞内SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用。实际上，与 H1299 细胞相比，更高的整体 m 6 A 甲基化在H1975细胞中引起了更强的SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用。从 METTL3 在 H1299 和 H1975 细胞中的功能获得和丧失实验中，我们还得出结论，细胞内SLC7A1 1 mRNA-YTHDC2 相互作用是由 m 6 A 水平决定的。这些数据表明YTHDC2优先结合m 6 A-甲基化的SLC7A1 1 mRNA。

然后，我们检查了YTHDC2 是否通过假定的m6A 位点使SLC7A1 1 mRNA不稳定。我们克隆野生型（WT）SLC7A11 3'UTR和突变型（MUT）3'UTR的萤火虫荧光素酶的下游pmirGLO 质粒中的编码区。结果表明，仅过表达 YTHDC2 WT而不是过表达YTHDC2 ΔYTH 会降低H1299 细胞中SLC7A1 1 mRNA 的稳定性，而敲除 YTHDC2 可增加其在 H1975 细胞中的稳定性。然而，与 WT 3'UTR 相比，Mut 报告基因的这些影响减弱了。在检查pmirGLO 质粒表达的外源F-Luc-SLC7A11融合 mRNA的 RNA 稳定性后，获得了类似的结果。。总体而言，3'UTR的 m 6 A 位点对于 YTHDC2 破坏SLC7A1 1 mRNA 的稳定性至关重要。

具有 YTHDC2 抑制的 LUAD 对系统 X C -靶向治疗敏感

为了评估 YTHDC2 抑制在 LUAD 中的重要性，患者样本中随机选择了20 个 YTHDC2低LUAD，其中 50% 属于腺泡亚型。。要了解YTHDC2的患病率较低的腺泡亚型，另一种群组＃2被吸收特定于腺泡亚型。在队列#2（n = 100）中，与邻近组织相比，肿瘤中的 YTHDC2 下调，并且 62%（62/100）的腺泡组织被归类为 YTHDC2低与没有这种表达模式的患者相比，YTHDC2低的腺泡 LUAD 患者的总生存期要短得多。进一步证明 YTHDC2 抑制可能对腺泡 LUAD 的肿瘤进展特别重要。

YTHDC2抑制SLC7A11; 因此，我们推测 SLC7A11 在腺泡 LUAD 中同时上调。事实上，这在队列#2 中是正确的。最近，使用系统 X C -抑制剂。我们想知道哌嗪埃拉汀 (PKE) 是一种稳定的埃拉汀体内衍生物，是否对腺泡 LUAD 具有潜在的治疗作用。此外，同时对索拉非尼进行了检查。PDX 小鼠模型对于评估患者的治疗敏感性很有价值。因此，来自 4 名不同腺泡 LUAD 患者的 PDX 模型被给予 PKE 和索拉非尼。由于小鼠传代，未观察到 YTHDC2 和 SLC7A11 的组织病理学和表达的显着变化。与 DMSO 处理的对照相比，当给予 PKE 和索拉非尼时，观察到显着的肿瘤消退。此外，给小鼠服用PKE和索拉非尼也会导致肿瘤中MDA和4-HNE的显着增加。表明诱导的脂质过氧化可能是抑制腺泡 LUADs 肿瘤发生的结果。

最后，我们招募了另外两个队列来验证我们的结论。虽然第 3 组 LUAD 患者是从华北招募的，第 4 组也从中国上海招募，但时间范围与第 1 组不同。与队列#1 的观察结果相似，MDA 和 YTHDC2 受到抑制，而与队列 #3 中的邻近组织相比，肿瘤中 SLC7A11 的 mRNA 和蛋白质水平均升高（n = 30），证实了 LUAD 中 YTHDC2 的抑制通过上调 SLC7A11 来防止脂质过氧化。在队列#4（n = 20/每个阶段）中，MDA 和 YTHDC2 呈负相关，而 SLC7A11 与阶段正相关，表明 SLC7A11 升高可能是抑制 YTHDC2 以促进 LUAD 进展的关键