circPDE3B促进食管癌进展

越来越多的证据表明，circRNAs作为功能性RNA在各种癌症中发挥着关键作用。然而，大多数circRNA参与食管鳞状细胞癌(ESCC)的机制仍未明确，其介导的分子机制也大多不清楚。小编给大家分享2021年7月发表于“CELL DEATH & DISEASE”（IF=8.469）的文章“Circular RNA hsa_circ_0000277 sequesters miR-4766-5p to upregulate LAMA1 and promote esophageal carcinoma progression”。在这里，我们筛选了circRNA在ESCC组织中的表达谱，发现与正常对照组相比，hsa_circ_0000277(称为circPDE3B)在ESCC组织和细胞系中的表达显著增加。circPDE3B在ESCC患者中的高表达与晚期TNM分期和预后不佳相关。功能实验表明，circPDE3B在体外和体内均能促进ESCC细胞的发生和转移。circPDE3B可以作为ceRNA，通过miR4766-5p来消除对LAMA1的抑制作用。此外，LAMA1在ESCC组织中显著上调，并与侵袭性致癌表型呈正相关。更重要的是， circPDE3B在ESCC中的致癌作用部分依赖于miR-4766-5p/LAMA1轴。生物信息学分析结合验证实验表明，上皮-间充质转化(EMT)激活参与了circPDE3B-miR-4766-5p /LAMA1轴在ESCC中的致癌功能。

技术路线

结果

1）circPDE3B在ESCC组织和细胞系中表达上调

我们使用circRNA微阵列分析了三对ESCC组织样本来研究ESCC组织的circRNA表达谱。与匹配的非肿瘤组织相比，ESCC组织中hsa_circ_0000277(也称为circPDE3B)的表达显著增加(图1A，B)。将PDE3B mRNA序列与来自circBase的预期circPDE3B序列进行比较，发现circPDE3B是环状的，包含其亲本基因的2-4外显子(图1C)。我们使用Sanger测序来确认头尾拼接(图1D)。RT-PCR表明circPDE3B只能在cDNA中扩增，而不能在gDNA中扩增(图1E)。我们使用RNase R来确认circPDE3B的稳定性。RNase R显著降低PDE3B线性形式的水平，但不消化circPDE3B(图1F)。对放线菌素D的抗性也证实了circPDE3B的环状结构(图1G)。接下来，我们通过qRT-PCR研究circPDE3B在ESCC细胞株中的表达。circPDE3B在ESCC细胞系中表达上调(图1H)。此外，qRT-PCR检测到92对ESCC样本中circPDE3B的表达高于相邻正常样本(图1I)。原位杂交(ISH)也证实circPDE3B表达升高(图1J)。因此，我们随后的实验聚焦于circPDE3B在ESCC进展中的作用。

2）circPDE3B表达上调与ESCC临床预后不良相关

为了研究circPDE3B表达与ESCC临床病理特征的相关性，我们将92例ESCC患者分为低circPDE3B表达组和高circPDE3B表达组。采用卡方检验评估两组间的临床病理因素。图2A-C显示较高的circPDE3B表达与淋巴转移、晚期 TNM分期和较差的组织学分级呈正相关。无病生存率(DFS)的单因素Cox比例风险分析显示，circPDE3B表达是一个重要的预后因素(图2D)。此外，Kaplan-Meier分析显示，与circPDE3B低表达的患者相比，circPDE3B高表达的ESCC患者表现出较差的OS和DFS率(图2E, F)。这些结果表明，circPDE3B上调参与了ESCC的进展，可能是一个潜在的预后靶点。

3）circPDE3B促进体外ESCC细胞生长和侵袭

我们使用功能缺失和功能获得策略来研究circPDE3B在ESCC细胞中的生物学功能。CCK-8结果表明circPDE3B敲低显著抑制了TE-1和EC9706细胞的增殖能力(图3A)。菌落形成实验表明，circPDE3B对保持高的菌落形成能力有重要影响(图3B)。同样，EdU实验表明，circPDE3B敲低抑制了ESCC细胞的DNA合成率(图3C)。Transwell分析显示，与sh-NC(阴性对照)组相比，sh-circPDE3B组迁移和侵袭的细胞明显更少(图3D)。此外，circPDE3B过表达与细胞生长能力显著增加相关(图3E-G)，并大大增强TE-10和KYSE-410细胞的迁移和侵袭潜能(图3H)。综上所述，这些数据表明circPDE3B在体外可促进细胞增殖，显著增强ESCC细胞的侵袭和迁移。

4）circPDE3B在内促进ESCC细胞生长和侵袭

我们通过在裸鼠右侧皮下注射circPDE3B基因敲除的EC9706细胞建立异种移植瘤模型，并注射小鼠侧尾静脉建立肺转移模型，验证沉默circPDE3B对肿瘤生长和转移的抑制作用。我们使用活体成像系统每3天动态监测肿瘤的生长情况。circPDE3B敲低导致皮下肿瘤中的荧光信号显著降低(图4A)。肿瘤在接种circPDE3B敲低EC9706细胞的小鼠中发展更慢(图4 B，C)。qRT-PCR检测到在circPDE3B沉默的异种移植瘤中较低的circPDE3B表达(图4D)。此外，与阴性对照相比，circPDE3B沉默的异种移植瘤具有更少的Ki-67阳性核(图4E)。与NC细胞相比，接种circPDE3B沉默的EC9706细胞的小鼠的肺微转移灶更少、更小(图4F)。综上所述，circPDE3B敲低可以抑制ESCC细胞的生长和体内转移潜能。

5）circPDE3B通过海绵化miR-4766-p发挥其功能

FISH显示circPDE3B主要定位于细胞质。因此，我们进一步探讨了circPDE3B是否在ESCC细胞中海绵miRNAs。我们通过starBase和circBank将circPDE3B序列miRNA识别元件的预测结果重叠，选择两个候选miRNA(图5A)。然后，我们检测候选miRNAs是否可以直接结合circPDE3B。qRT-PCR显示，在ESCC细胞中，miR-4766-5p而非miR-2114-3p显著下调了circPDE3B的表达(图5B, C)。circPDE3B过表达降低了miR-4766-5p的表达，而circPDE3B敲低则增强了miR-4766-5p的表达(图5D)。我们还预测了miR-4766-5p和circPDE3B结合位点(图5E)，并使用双荧光素酶报告基因检测circPDE3B荧光素酶强度。miR-4766-5p显著抑制了野生型circPDE3B的荧光素酶强度，但突变型circPDE3B未受影响(图5F)。此外，AGO2免疫沉淀分析表明，与NC组相比，miR-4766-5p捕获的部分具有circPDE3B的>5倍富集(图5G)。与正常组织相比，ESCC组织中miR-4766-5p的表达显著降低(图5H)。ESCC组织中miR-4766-5p与circPDE3B表达水平呈负相关(图5I)。在验证了circPDE3B与miR-47665p之间的相互作用后，我们检测了circPDE3B的致癌功能是否归因于其对miR-4766-5p的抑制作用。miR-4766-5p过表达显著抑制了转染的TE-1和EC9706细胞的增殖能力，而与circPDE3B载体共转染部分逆转了抑制作用(图5J，K)。circPDE3B上调逆转了异位miR-4766-5p表达导致的迁移和侵袭性细胞数量的减少(图5L，M)。这些结果表明，circPDE3B至少部分通过调节miR-4766-5p来促进ESCC细胞的侵袭性致癌表型。

6）circPDE3B通过miR-4766-5p调控LAMA1

我们使用了TargetScan和starBase来识别miR-4766-5p的假定靶基因，同时根据TCGA)析筛选出ESCC组织中上调的候选mRNA。我们选择10种候选mRNA (ALX1, CENPK, DNMT3B, ELOVL2, FNDC1, GINS1, HELLS, LAMA1, ONECUT2, RTKN2)进行qRT-PCR验证(图6A)。miR-4766-5p调节 LAMA1、ELOVL2和ONECUT2的mRNA水平(图6B)，但与NC相比，仅LAMA1的蛋白水平有显著变化(图6C)。我们进行了双荧光素酶报告基因实验，以确认LAMA1和miR4766-5p是否直接相互作用。转染的miR-4766-5p和野生型LAMA1的荧光素酶报告基因活性显著降低，而突变型LAMA1的荧光素酶报告基因活性没有明显改变(图6D)。此外，通过相关性分析，miR-4766-5p与LAMA1在ESCC组织中呈负相关，提示可能存在结合能力(图6E)。基于以上发现，我们假设circPDE3B通过海绵miR-4766-5p调控LAMA1的表达。qRT-PCR和western blotting结果显示，在ESCC细胞中，circPDE3B敲低显著降低了LAMA1的表达，而circPDE3B强制表达显著增强了LAMA1的表达(图6F，G)。拯救实验显示，miR-4766-5p模拟物部分逆转了circPDE3B过表达对LAMA1表达的启动子效应(图6H)。此外，circPDE3B和LAMA1在ESCC组织中表达的相关性研究显示二者显著正相关(图6I)。同时，LAMA1较强的免疫组化染色强度与ESCC组织中circPDE3B表达升高呈正相关(图6J)。总之，我们的发现证实了我们的假设，circPDE3B海绵miR-4766-5p，随后增加LAMA1的表达。

7）circPDE3B的致癌作用部分依赖于LAMA1

为了研究LAMA1在ESCC侵袭表型中的作用，我们进行了qRT-PCR，结果表明LAMA1在ESCC细胞系(图7A)和组织(图7B)中过表达。TCGA ESCC数据集也得到了类似的结果(图7C)。同样，对10对匹配的ESCC组织和相邻的非癌组织进行western blotting，发现在ESCC组织中LAMA1表达显著上调(图7D)。通过免疫组化研究LAMA1在组织中的表达，发现ESCC组织比相邻的非癌组织具有更强的LAMA1染色(图7E)。与LAMA1低表达的患者相比，LAMA1高表达的患者平均OS和DFS天数减少(图7F)。这些结果均提示LAMA1可能在ESCC进展中发挥致癌作用。接着，我们验证了circPDE3B在ESCC中的致癌活性是否依赖于LAMA1。CCK-8和集落形成实验表明，抑制LAMA1表达可损害细胞增殖。然而，共转染circPDE3B载体显著逆转了这种抑制作用(图7G，H)。同样，与circPDE3B载体共转染后，LAMA1沉默诱导的受损细胞迁移和侵袭能力被消除(图7I，J)。为了探讨circPDE3B/miR-4766-5p/LAMA1轴对体内ESCC生长和转移的影响，我们建立了以下四个EC9706细胞组：NC (sh-NC)、稳定的LAMA1敲低(sh-LAMA1)、稳定的circPDE3B过表达(circPDE3B和sh-NC)、稳定的circPDE3B过表达伴有LAMA1抑制(circPDE3B和sh-LAMA1)。体内肿瘤形成实验表明，与NC相比，LAMA1敲低显著抑制了肿瘤的生长，而circPDE3B过表达极大地促进了肿瘤的生长(图7K)。此外，LAMA1的抑制部分消除了circPDE3B过表达对肿瘤生长的促进作用。LAMA1沉默主要降低Ki-67的表达，circPDE3B重引入可逆转这一现象(图7L)。有趣的是，LAMA1的下调大大降低了转移瘤的数量和大小，而强化的circPDE3B表达再次抵消了这一变化(图7M)。总的来说， circPDE3B的致癌作用部分依赖于LAMA1。

8）circPDE3B/miR-4766-5p/LAMA1轴通过激活EMT促进ESCC进展

我们研究了circPDE3B/miR-4766-5p/LAMA1轴参与ESCC进展的基本机制。KEGG分析(图8A)、GSVA(图8B)、GSEA(图8C)表明LAMA1高表达与EMT激活密切正相关，提示EMT可能是LAMA1在ESCC中致癌作用的原因。正如预期的那样，western blotting显示，LAMA1敲低后，MMP2/7/9、N-cadherin、Snail、Slug和vimentin的蛋白水平降低，E-cadherin的蛋白水平升高(图8D，E)。此外，circPDE3B沉默后也观察到类似的抑制作用(图8F)。拯救实验发现，miR-4766-5p inhibitor共转染显著逆转了circPDE3B沉默诱导的EMT抑制作用(图8F)， 然而LAMA1 siRNA共转染显著逆转了circPDE3B过表达诱导的EMT促进作用。总之，circPDE3B/miR-4766-5p/LAMA1轴通过激活EMT促进ESCC进展。

结论：我们的研究结果表明，circPDE3B在食管鳞癌组织中上调，circPDE3B高表达是食管鳞癌患者生存不良的独立预后因素。CircPDE3B通过miR-4766-5p来促进LAMA1的表达，从而促进ESCC细胞的肿瘤发生和转移。circPDE3B-miR-4766-5p LAMA1轴通过激活EMT调控ESCC进展。circPDE3B miR-4766-5p LAMA1轴因此可能作为食管鳞癌预后的生物标志物和治疗靶点。