m6A调控的lncRNA LCAT3在肺癌中发挥致癌作用
栏目:最新研究动态 发布时间:2021-09-09
本文介绍了一种新的致癌lncRNA-LCAT3在肺癌发生中的调控机制。我们通过分析TCGA中肺癌组织的RNA-seq数据预测并验证了LCAT3......



lncRNA是重要的表观遗传调控因子,在多种生理和病理过程中发挥着重要作用。然而,lncRNA在肺癌发生中的调控机制尚不清楚。20217月发表于Journal of Hematology & OncologyIF=17.388)的文章LCAT3, a novel m6Aregulated long noncoding RNA, plays an oncogenic role in lung cancer via binding with FUBP1 to activate cMYC介绍了一种新的致癌lncRNA-LCAT3在肺癌发生中的调控机制。我们通过分析TCGA中肺癌组织的RNA-seq数据预测并验证了LCAT3。通过甲基化RNA免疫沉淀来评估m6ALCAT3的修饰。LCAT3-FUBP1-MYC轴通过双荧光素酶报告、RNA免疫沉淀和染色质免疫沉淀检测被评估。利用RNA-seq技术鉴定了LCAT3基因敲低改变的信号通路。此外,通过体内和体外的功能丧失和功能获得试验,研究了LCAT3的作用机制。结果表明,LCAT3在肺腺癌(LUAD)中表达上调,其过表达与LUAD患者的不良预后相关。LCAT3上调可归因于甲基转移酶3 METTTL3)介导的m6A修饰,导致LCAT3稳定。生物学上,功能缺失分析显示,在体外,LCAT3敲低显著抑制肺癌细胞增殖、迁移和侵袭,在体内,抑制肿瘤生长和转移。LCAT3敲低诱导细胞周期阻滞在G1期。在机制上,LCAT3FUBP1招募到MYCFUSE序列上从而激活MYC转录,促进肺癌细胞的增殖、存活、侵袭和转移。

 

技术路线


 

 

结果:

1LCAT3在肺癌中上调,与预后不良呈正相关

在本研究中,我们研究了一种新的lncRNA,命名为LCAT3TCGARNA-seq数据分析表明,与相邻正常组织相比,LCAT3LUAD组织中显著上调(1A)。我们进一步用qRT-PCR验证了LCAT313对肺癌样本和相应的非癌肺样本中的表达。与RNA-seq数据一致,qRT-PCR结果证实LCAT3在肺癌组织中上调(1B)。重要的是,Kaplan-Meier生存分析显示,LCAT3表达水平较高的LUAD患者总生存期和无病生存期均短于LCAT3表达水平较低的LUAD患者(1C, D)。采用CPATCPC2计算LCAT3蛋白编码能力。LCAT3编码蛋白质的潜力低于其他经典的lncRNA,如XISTHOTAIR(1E, F),表明LCAT3最有可能是一种lncRNA。亚细胞定位分析显示,LCAT3分布在细胞核和细胞质中(1G, H)


 

2METTTL3是肺癌中LCAT3上调的原因

m6A修饰是mRNAlncRNA最普遍的转录后修饰,并调节其翻译、稳定性等。我们的生物信息学分析显示,核心m6A甲基转移酶METTTL3确实在LUAD中上调(2A)。因此,我们使用CRISPR/Cas9系统敲除肺癌细胞中的METTTL3western bolt证实了敲除效率(2B)。我们发现METTTL3的耗竭明显降低LCAT3表达水平(2C, D)。此外,MeRIP-seq显示在A549细胞中,LCAT3m6A修饰富集,METTL3敲除后m6A水平降低(2E)。随后MeRIP-qPCR证实METTL3敲除显著降低了LCAT3 m6A修饰水平(2F)。最后,我们用放线菌素D处理肺癌细胞以阻断转录,发现METTTL3敲低显著降低LCTA3转录本的半衰期(2G, H)。总之,METTTL3介导的m6A似乎是LUADLCAT3上调的原因,可能是通过稳定其转录本。



3LCAT3在体内和体外均可促进肺癌细胞增殖

为了研究LCAT3在肺癌细胞中的生物学功能,我们使用siRNA沉默了Calu1Hop62肺癌细胞中的LCAT3,这充分降低了LCAT3的表达(3A)CCK-8检测显示,LCAT3沉默后,细胞增殖明显受到抑制(3B)。同样,集落形成分析也显示,与siRNA-NC相比,LCAT3敲除可显著减少细胞集落(3C, D)。此外,EdU分析显示,LCAT3敲除可显著减少肺癌细胞中的DNA复制(3E, F)。为了进一步评估LCAT3在体内的致癌作用,我们用shRNA稳定敲除Calu1Hop62细胞中的LCAT3,并通过皮下注射建立移植瘤小鼠模型(3G)。与shRNA NC组相比,LCAT3敲低组的肿瘤体积和肿瘤重量显著降低(3H, I)。总体而言,LCAT3对体外和体内肺癌细胞的生长和生存都至关重要。



4LCAT3对肺癌细胞迁移、侵袭和细胞周期进展的影响

我们探讨了LCAT3对肺癌细胞迁移和侵袭的影响。Transwell分析显示,LCAT3敲低抑制了Calu1Hop62细胞的迁移和侵袭(4A, B)。为了探究LCAT3是否也在体内调节肺癌转移,我们将荧光素标记的对照或LCAT3沉默的Calu1细胞静脉注射到裸鼠体内,然后每周对裸鼠进行一次生物发光成像(BLI)。持续的BLI监测显示,4周后注射LCAT3沉默的Calu1细胞的小鼠肺部转移性生长显著下降(4C, D)。为确定LCAT3基因敲除是否影响肺癌细胞周期,采用流式细胞术检测LCAT3基因敲除和NC肺癌细胞。LCAT3敲低导致G1阻滞(4E, F)Western blot检测证实,一些细胞周期相关蛋白,如cyclin A2, cyclin B1cyclin D1LCAT3敲低后明显下调(4G)。为了进一步分析LCAT3对肺癌的影响,我们对LCAT3敲除的肺癌细胞进行了RNA-seqKEGG通路和GO富集分析显示最显著的KEGG通路和GO项是与细胞周期和细胞分裂相关的,这表明LCAT3沉默导致了细胞周期调控基因的显著改变(4H, I)



5LCAT3FUBP1发生物理作用,FUBP1LUAD中也过表达

为了阐明LCAT3在肺癌细胞中作用的潜在分子机制,我们进行了RNA下拉试验来鉴定LCAT3结合蛋白。从凝胶中剪切LCAT3义和反义之间的明显波段用于质谱分析(5A)FUBP1因其与LCAT3的特异性结合而被选择进行进一步研究(5B)。此外,采用抗FUBP1抗体进行RIP检测,进一步证明FUBP1LCAT3之间的相互作用(5C)。与FUBP1结合的核心序列为LCAT3208-342 nt,形成茎环结构。因此,我们使用LCAT3208-342 nt片段进行RNA拉下分析。结果证实该茎环区(208-342 nt)确实负责LCAT3FUBP1之间的结合(5D)。前人研究表明,FUBP1可以分为三个结构域,分别是抑制结构域、DNARNA结合结构域和转录结构域。因此,我们构建了flag标记的全长野生型FUBP1突变体的类型和三个缺失域突变体(5E)RIP实验显示,LCAT3主要结合于DNARNA结合区域(100-447aa)(5F)。综上所述,这些数据表明LCAT3FUBP1发生物理作用,LCAT3的茎环区(208-342 nt)FUBP1DNARNA结合域(100-447aa)LCAT3FUBP1结合所必需的。此外,我们发现,FUBP1mRNA和蛋白水平在LUAD中均显著上调(5G, H),且在肺癌患者中,FUBP1的高表达与较短的生存时间相关(5I)



6FUBP1沉默可抑制肺癌细胞的增殖和存活

FUBP1LUAD中的生物学功能尚未被报道,因此,我们通过siRNA敲除A549Calu1细胞中的FUBP1来评估肿瘤细胞表型的潜在变化。在FUBP1敲低(6A, B)时,我们观察到肺癌细胞的生长(6C)和菌落存活(6D)受到显著抑制。此外,与LCAT3敲低一样,FUBP1敲低也抑制A549Calu1肺癌细胞的迁移(6E, F),并通过显著降低cyclin A2cyclin D1水平触发G1阻滞(6H, I)(6G)。总的来说,FUBP1通过增强肺癌细胞的恶性表型发挥致癌作用。



7LCAT3FUBP1共同调控c-Myc的表达

我们假设LCAT3将与FUBP1合作调节MYC表达。结果表明,FUBP1的敲除显著抑制了c-MYC mRNA和蛋白质的水平(7 A, B) LCAT3敲除也显著降低c-MYC mRNA和蛋白的水平在A549Calu1细胞(7C, D)。因此,与FUBP1一样,LCAT3也是一个c-MYC阳性调节因子。有趣的是,虽然LCAT3FUBP1的敲低降低了c-MYC的水平,但同时敲低LCAT3FUBP1并不能进一步降低c-MYC的水平(7E, F),这表明LCAT3FUBP1在同一调控点调控c-MYC的表达。



8LCAT3招募FUBP1激活MYC转录

芯片分析表明,FUBP1在肺癌细胞中与c-MYC启动子结合(8A)FUBP1LCAT3敲低后显著降低(8 B, C)。因此,LCAT3似乎是FUBP1c-MYC启动子结合所必需的。然后,然后,我们测试了LCAT3是否通过将FUBP1招募到c-MYC启动子上的FUSE序列中来激活c-MYC表达。使用c-MYC启动子驱动的荧光素酶报告基因,在有或没有FUSE序列的情况下(8D),我们发现LCAT3FUBP1基因敲低后,c-MYC启动子活性受到抑制,这种抑制方式依赖于FUSE序列(8E, F)。因此,LCAT3FUBP1招募到MYC FUSE序列中来激活其转录。



结论:我们鉴定并表征了肺癌中m6A调控的新lncRNA -LCAT3METTTL3通过m6A修饰稳定LCAT3。过表达的LCAT3FUBP1招募到c-MYC启动子上,以激活c-MYC表达,导致肺癌细胞增殖、存活、迁移/侵袭和转移增强。我们的研究揭示了LCAT3-FUBP1-cMYC轴的致癌作用,并将其描述为一个有前景的预后生物标志物和潜在的肺癌治疗靶点。