一类新的tsRNA标记作为胰腺癌诊断和预后的生物标志物
胰腺癌（PC）是全世界癌症相关死亡率的第三大原因，大多数PC患者在确诊后都已进展到晚期。因此对早期诊断和预后具有高敏感性和特异性的新型生物标志物的鉴定是目前提高PC治疗效果的最佳策略。最近有研究发表一种tsRNA谱可以作为早期诊断和/或预测PC的临床结果的指标，该研究于2021年7月发表在《Molecular Cancer》，IF：15.302。
技术路线：
主要结果：
为了探究血清tsRNA是否可以作为PC的新生物标志物，作者通过小RNA测序进行初步筛选，然后在个体基础上进行qRT-PCR验证。首先，从30例PC患者和30例健康对照者血清中提取RNA进行测序。长度分析显示，两组RNA的分布不同(图S1A)。在检测到的433个tsRNA和1121个miRNAs中，与健康对照组相比，PC组中tsRNA的变异更大(图1A, B)，这表明tsRNA可能是检测PC更敏感的生物标志物。分析结果显示，与健康对照组相比，PC血清中有26个显著差异的tsRNA (图1 C)。采用绝对定量和相对比较的方法，在24名健康对照和24名PC患者的个体血清样本中，验证前10位上调tsRNA中的6个候选基因的差异表达。与健康对照组相比，PC血清中6种tsRNA中有4种显著升高(图1D)。相对比较分析显示，6个tsRNAs中有2个(tRF-Pro-AGG-004, tRFLeu- CAG-002)在PC患者中显著增加(图S2)。然后评估了两种tsRNA对风险评分预测的影响，ROC分析显示，tRF-Pro- AGG-004和tRF-Leu –CAG-002具有更高的AUC(图S3)。总之，tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002可以作为PC检测的候选。
图S1 PC患者和正常健康对照组血清中小RNA的分析
图S3血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的ROC曲线
2. 血清tsRNAs差异表达对胰腺癌的诊断价值
接下来，在两家医院的血清样本中进一步分析了这两种tsrna的表达。与对照组相比，PC血清中tsRNAs显著升高。采用ROC分析确定2- tsRNAs谱的诊断价值。这两种tsrna单独在AUC下显示出较高的诊断价值(tRF-Pro-AGG-004: 0.90;tRF-Leu-CAG-002: 0.78)和性能(tRF-Pro-AGG-004:敏感性72.5%，特异性98.8%;tRF-Leu-CAG-002:敏感性64%，特异性77.2%)(图1F)。在联合分析中，与单个tsRNA相比，2个tsRNA的特征具有更高的AUC和更高的性能 (图1G)。ROC分析显示，2-tsRNAs特征比CA19-9和CEA（临床PC生物标志物CA19-9和CEA）具有更高的诊断潜力(图1G)。有趣的是，2-tsRNAs组合对早期PC患者(I期和II期)的诊断准确率明显更高，AUC为0.84，敏感性为75.0%，特异性为83.0%(图1H)，优于CA19-9(敏感性63.5%，特异性59.6%)和CEA(敏感性63.1%，特异性58.5%)。此外，在其他类型的疾病(包括HCC、BRC、NSCLC等)中检测tRF-Pro-AGG-004和tRF-LEU-CAG-002的表达，表明联合的2-tsRNAs特征在PC中具有一定的疾病特异性(图1I)。这些结果表明，血清tRFPro- AGG-004和tRF-Leu-CAG-002即使在早期也可以作为诊断PC的新型生物标志物。
3. 血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的升高源于肿瘤组织
为了确定PC血清中两种tsRNAs的高水平是否是由PC组织中的扰动引起的，首先检查了独立临床队列中相同患者的组织和配对血清中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的水平，并观察到正相关(图2A)。为了进一步探讨PC细胞是否释放出增加的tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002，在不同时间段的PANC1培养基中研究了tsRNAs的表达。作者发现它们的表达与细胞数量和培养时间成正比(图2B)。此外，细胞中两种tsRNAs抑制剂处理后，培养基中tsRNAs水平降低(图2C)，说明培养基中的tsRNAs直接从PC细胞中释放出来。tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu- CAG-002的定量显示，与对照组小鼠相比，PC小鼠的肿瘤组织和血清标本中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu- CAG-002的表达显著升高(图2D)。此外，两种tsRNAs的血清水平与肿瘤重量之间存在显著正相关(图2E)。综上所述，这些结果表明，血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的升高源于肿瘤组织。
作者还检测了循环tsRNA的存在形式，并分别从PC患者血清、PC小鼠血清和PANC1细胞培养基的外泌体和无外泌体上清中分离出总RNA。有趣的是，结果显示，tRF-Pro-AGG-004在无外泌体的上清中高度富集，而tRF-Leu-CAG-002优先存在于外泌体中(图2F)。两种循环tsRNA的不同形式表明了它们不同的作用和系统调节机制。
4. PC患者肿瘤组织中2个tsRNAs标记的预后潜力
传统的病理分期系统在预测预后方面可能已经达到了极限，而新的分子生物标志物可能会增加价值。因此，作者通过标准流程的ISH分析对2个临床PC队列中的2 - tsRNAs表达进行检查和评分。结果显示，与正常组织相比，PC组织中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002显著上调(图S6)。当根据生存时间将患者分为较短生存组和较长生存组时，较短生存组的tsRNAs均显著升高(图2G, H, J)。设置ISH的最佳临界值时(ISH分数>3为高，ISH分数<3低)，tRF-Pro-AGG-004高和/或tRF-Leu-CAG-002高的PC患者的预后明显更差(图2I, K)。这些结果提示，tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的ISH评分可以作为预测患者术后生存时间的有价值的生物标志物。
图2 tsRNAs在肿瘤组织升高作为预测PC患者生存时间的独立指标
5. 胰腺癌中被血管生成素切割的tsRNAs增加
为了进一步探讨这两种tsRNAs产生的机制，利用IHC芯片检测了60对PC肿瘤和正常组织中参与tsRNAs加工的主要酶，包括ANG和Dnmt2。34/60例(56.7%)PC患者ANG明显升高，而Dnmt2在两组间无显著差异(图3A，图S7)。TCGA分析也得到了类似的结果(图3B)。这些结果表明，肿瘤组织中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002上调可能是ANG切割增加所致。ANG较高的PC患者总生存时间明显缩短(图3C)。转染ANG siRNA导致PC细胞和培养基中tRF-Pro- AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的减少(图3D)。此外，在PC原位移植肿瘤模型中，使用体内优化的RNAi去除ANG显著降低了肿瘤和血清tsRNAs水平(图3E-I)。这些结果表明，上调的tsRNAs可能是通过ANG的切割增加而产生的，ANG可能是PC治疗的一个潜在靶点。
6. tRF-Pro- AGG-004和tRF-Leu-CAG-002在胰腺癌中的作用
一些tsRNAs可能在结构和功能上与miRNA相似，直接与靶mRNA结合，导致翻译抑制。通过体内和体外实验评估了两种tsRNAs在胰腺癌中的功能意义。将感染的细胞皮下移植到六周大的裸鼠体内。细胞植入后30天评估肿瘤生长情况(图3J,K)。与对照组相比，tsRNA过表达组移植瘤的重量或体积更高或更大(图3L,M)。此外，EdU检测显示，tsRNAs模拟物加速了PANC1的增殖，而抑制剂则延缓了细胞的增殖(图3N)。Transwell实验表明，过表达tsrna促进细胞侵袭，而抑制两种tsrna则抑制细胞侵袭(图3O)。综上所述，这些数据表明这两种tsRNAs在胰腺癌中起着肿瘤启动子的作用。
总结：
首先在PC患者中发现了一种新的血清双tsRNAs特征。然后，证明即使在早期血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002可以作为新的有前景的生物标志物用于PC诊断。此外，结果表明，肿瘤组织中tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002的ISH评分可以作为预测患者术后生存时间的有价值的生物标志物。揭示了这两种新的血清tsRNAs的起源、存在形式和潜在的生物学功能。需要进行随机临床试验来评估双tsRNAs标记在胰腺癌早期诊断和预后中的可能应用。
参考文献：
Jin F, Yang L, Wang W, Yuan N, Zhan S, Yang P, Chen X, Ma T, Wang Y. A novel class of tsRNA signatures as biomarkers for diagnosis and prognosis of pancreatic cancer. Mol Cancer. 2021, 20(1):95. doi: 10.1186/s12943-021-01389-5