国自然热点之外泌体

外泌体是胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外的膜性小囊泡，是细胞间信号传输的载体。外泌体最近几年受到广泛关注，成为生物医学科学研究的新宠儿。文章发表数目飞速增长，外泌体成为研究热点是大致可以认为从2014年开始。2013年，诺贝尔生理学或医学奖授予美国科学家詹姆斯·罗思曼、兰迪·谢克曼及德国科学家托马斯·祖德霍夫，以表彰其在细胞间囊泡运输调控机制领域作出突出贡献，将外泌体研究的热度推向高潮。2020年外泌体相关课题中标两千余项。

但是现阶段的外泌体研究主要是与其他研究热点结合例如，miRNA、lncRNA、circRNA。今天讲一下外泌体相关研究。这篇文献题目为：Warburg effect-promoted exosomal circ_0072083 releasing up-regulates NANGO expression through multiple pathways and enhances temozolomide resistance in glioma。该文章主要讲述了外泌体circ_0072083通过调节神经胶质瘤中miR-1252-5p介导的降解和去甲基化来增加NANOG表达，从而促进TMZ抗性。

circ_0072083 丰度在 TMZ 抗性神经胶质瘤组织和细胞中增加

证实替莫唑胺（TMZ，胶质瘤化疗药）抗性组织的 MGMT 启动子甲基化比例低于 TMZ 敏感样品。为了探讨circ_0072083 是否参与胶质瘤中的TMZ抗性，测量了circ_0072083在抗性和敏感组织中的表达变化。TMZ 抗性组织（n  = 36）中的circ_0072083 丰度高于敏感组织（n  = 33）。此外，构建了TMZ抗性细胞系（U251/TR和U87/TR），其 TMZ的IC50 高于敏感细胞。circ_0072083在抗性细胞（U251/TR和U87/TR）中的丰度比敏感细胞（U251和U87）增加了2 倍以上。此外，还分析circ_007208的信息和结构CircView软件显示circ_0072083 是ZFR转录本的外显子 2 与外显子20的反向剪接产生的。此外，在两种细胞系中，circ_0072083对放线菌素D和RNase R的抗性比相应的线性RNA更强，表明 circ_0072083 的圆形结构。此外，circ_0072083主要在U251/TR和U87/TR细胞的细胞质中表达。为了抑制细胞中的circ_0072083，构建了三种靶向 circ_0072083 剪接点的siRNA，并证实了它们的功效。

circ_0072083 敲低降低了 TMZ 抗性神经胶质瘤细胞中的 TMZ 抗性

为了研究circ_0072083对TMZ抗性的作用，用sh-circ_0072083或sh-NC 转染U251/TR和U87/TR细胞。用于稳定转染的sh-circ_0072083是基于具有最高敲低效率的si-circ_0072083#1序列构建的。sh-circ的转染诱导U251/TR 和 U87/TR 细胞中circ_0072083 水平降低 65% 以上。circ_0072083 敲低明显降低了 U251/TR 和 U87/TR 细胞中TMZ的IC50。接下来，在用TMZ (50 μg/mL) 处理的细胞中进行功能分析。在TMZ存在的情况下，circ_0072083沉默通过降低增殖和集落形成的能力显着抑制细胞增殖。此外，在TMZ存在下，circ_0072083干扰明显增加了U251/TR和U87/TR细胞的凋亡。此外，敲低circ_0072083显着削弱了通过TMZ攻击的两种细胞系的迁移和侵袭能力。此外，在异种移植模型中研究了 circ_0072083对 TMZ 功效的影响。用sh-circ_0072083或sh-NC转染U251/TR细胞建立异种移植模型，然后用TMZ（20mg/kg）或PBS处理小鼠。与 sh-NC + TMZ 组相比，sh-circ + TMZ 组的肿瘤体积和重量明显减少。此外，与 sh-NC + TMZ 组相比，sh-circ_0072083 + TMZ 组中的 circ_0072083 丰度显着降低。这些结果表明，circ_0072083 沉默减弱了胶质瘤中的 TMZ 抗性。

circ_0072083 沉默通过调节 ALKBH5 介导的 TMZ 抗性神经胶质瘤细胞中的去甲基化抑制 NANOG 水平

为了探索ALKBH5和NANOG是否需要通过circ_0072083调节TMZ抗性，在TMZ抗性组织和细胞中检测了它们的水平。与敏感组相比，TMZ抗性组织和细胞中ALKBH5和NANOG mRNA水平显着升高。与敏感组相比，TMZ抗性组的NANOG mRNA m6A水平明显降低。此外，在TMZ抗性组织和细胞中，ALKBH5和NANOG蛋白水平明显增加。并且使用sh-ALKBH5转染通过 ALKBH5沉默显着降低了NANOG 表达。RIP分析显示NANOG可以在 U251/TR和U87/TR 细胞中被 ALKBH5 富集。此外，ALKBH5沉默明显增强了NANOG mRNA的m6A水平并降低了响应放线菌素D的NANOG mRNA稳定性。此外，在 U251/TR 和 U87/TR 细胞中评估了circ_0072083对ALKBH5 和NANOG表达的影响。结果表明，circ_0072083 沉默显着降低了ALKBH5和 NANOG 的丰度，并增加了 NANOG mRNA 的 m6A 水平。显示多蛋白复合物（METTL3、METTL14 和 WTAP）介导 NANOG mRNA 的 m6A 修饰以诱导其降解。circ_0072083 可以上调 ALKBH5 表达，其介导 NANOG mRNA 3'UTR 的去甲基化，导致NANOG mRNA 稳定性增加。这些数据表明circ_0072083可以通过调节ALKBH5介导的去甲基化来调节NANOG的表达。

circ_0072083 与 miR-1252-5p 相互作用以调节 TMZ 抗性神经胶质瘤细胞中的 ALKBH5/NANOG 轴和 TMZ 抗性

为了分析circ_0072083如何调节ALKBH5/NANOG轴，探索了潜在的 miRNA作为串扰。基于Circinteractome和starBase的数据库，维恩图显示只有一种miRNA（miR-1252-5p）可以与circ_0072083、ALKBH5和NANOG结合。 miR-1252-5p 表达在 TMZ 抗性组织和细胞中显着降低。为了验证它们的相互作用，构建了野生型和突变型荧光素酶报告载体。miR-1252-5p 过表达明显降低了野生型组（WT-circ_0072083、WT-NANOG 3'UTR 和 WT-ALKBH5 3'UTR）的荧光素酶活性，而没有改变突变组（MUT -circ_0072083，MUT-NANOG 3'UTR 和 MUT-ALKBH5 3'UTR）。此外，Ago2 RIP 分析表明 miR-1252-5p、circ_0072083、ALKBH5 和 NANOG 可以在同一复合物上富集。此外，在U251/TR和U87/TR 细胞中，通过circ_0072083 沉默，miR-1252-5p 水平明显增强。miR-1252-5p 过表达显着降低了 U251/TR 和 U87/TR 细胞中的 ALKBH5 和 NANOG 水平。此外，在用 sh-NC + anti-NC、sh-circ_0072083 + anti-NC 或 sh-circ_0072083 + anti-miR-1252-转染的细胞中研究了 circ_0072083/miR-1252-5p 轴对 ALKBH5 和 NANOG 水平的影响。ALKBH5和NANOG 水平通过circ_0072083沉默显着降低，这通过miR-1252-5p 敲低恢复。此外，miR-1252-5p 敲低逆转了 circ_0072083沉默介导的 TMZ IC50 降低、细胞增殖、迁移和侵袭以及促进 U251/TR 和 U87/TR 细胞凋亡。这些结果表明 circ_0072083 可以调节 miR-1252-5p/ALKBH5/NANOG 轴以控制胶质瘤细胞中的 TMZ 抗性。

外泌体circ_0072083的分泌依赖于TMZ抗性神经胶质瘤细胞中的Warburg效应

为了探索circ_0072083是否通过外泌体携带，从TMZ抗性和敏感细胞的培养基中分离外泌体。外泌体通过TEM 确认。大小主要在 100-200 nm，抗性细胞比敏感细胞具有更高浓度的外泌体。外泌体还通过特定标记物（CD63、CD81 和 TSG101）鉴定。此外，与 U251 和 U87 细胞相比，U251/TR 和 U87/TR 细胞中的外泌体 circ_0072083 水平明显升高。此外，在抗性细胞中发现了比敏感细胞更高的 Warburg 效应，这通过乳酸产生、葡萄糖摄取和关键酶（GLUT1、LDHA 和 PKM2）水平的增加来揭示。此外，抑制Warburg 效应（紫草素）显着降低了外泌体浓度和外泌体 circ_0072083 水平，但促进 Warburg 效应（TNF-α）起到了相反的作用。此外，外泌体浓度与葡萄糖浓度和 Warburg 效应水平呈正相关。先前的报告表明，表皮生长因子 (EGF) 和齐墩果酸 (OA) 可以增强或抑制外泌体分泌。在这里，发现了EGF和OA促进或抑制U251 / TR和U87 / TR细胞Warburg效应。此外，EGF 介导的外泌体分泌促进通过抑制 Warburg 效应（紫草素）而减轻；和 OA 介导的外泌体分泌抑制通过促进 Warburg 效应（TNF-α）被逆转。这些数据表明，在 TMZ 抗性神经胶质瘤细胞中外泌体 circ_0072083 的释放取决于 Warburg 效应。

来自抗性细胞的外泌体circ_0072083促进敏感神经胶质瘤细胞的TMZ抗性

为了研究外泌体circ_007208对TMZ抗性的作用，从U251/TR和U87/TR细胞敲低circRNA中分离外泌体，并与 U251 和 U87 细胞一起孵育。外泌体circ_0072083水平在转染sh-circ的U251/TR和U87/TR细胞培养基中明显降低。与PBS组相比，U251/TR-sh-NC EXO和U87/TR-sh-NC EXO孵育后U251和U87细胞中circ_0072083、ALKBH5和NANOG水平显着升高，miR-1252-5p表达降低，而这些事件通过 U251/TR-sh-circ_0072083 EXO 和 U87/TR-sh-circ_0072083 EXO 处理的细胞中的 circ_0072083 下调而减弱。此外，U251/TR-sh-NC EXO 和 U87/TR-sh-NC EXO 的孵育显着增强了 U251 和 U87 细胞中 TMZ 的 IC50，这通过 circ_0072083 敲低而减弱。此外，U251/TR-sh-NC EXO 和 U87/TR-sh-NC EXO 的引入在TMZ (50 μg/mL) 处理下明显促进细胞增殖、迁移和侵袭并抑制U251和U87细胞的凋亡，但这些U251/TR-sh-circ_0072083 EXO 和 U87/TR-sh-circ_0072083 EXO 组中的 circ_0072083 沉默缓解了事件。

通过U251细胞异种移植模型研究了外泌体circ_0072083对体内神经胶质瘤细胞生长的影响。通过 PBS + TMZ (20 mg/kg)、U251/TR-sh-NC EXO (10 μg) + TMZ (20 mg/kg) 或 U251/TR-sh-circ_0072083 EXO (10 μg) 处理异种移植小鼠+ TMZ（20 mg/kg）。通过添加 U251/TR-sh-NC EXO 显着增加了肿瘤体积和重量，而通过引入 U251/TR-sh-circ_0072083 EXO 可以减轻这种情况。此外，U251/TR-sh-NC EXO+TMZ组肿瘤组织中circ_0072083、ALKBH5和NANOG的丰度明显增加，miR-1252-5p表达降低，而这些事件在U251/TR-sh中逆转-circ_0072083 EXO + TMZ 组。这些结果表明外泌体 circ_0072083 增加了敏感细胞中的 TMZ 抗性。

外泌体circ_0072083与胶质瘤患者的TMZ耐药、诊断和生存有关

为了分析外泌体 circ_0072083 在胶质瘤患者中的价值，从患者的血清样本中分离外泌体。通过 TEM 和特定标记物（CD63、CD81 和 TSG101）验证外泌体。此外，大小主要在100-200 nm，并且在耐药患者中其浓度更高。此外，与TMZ敏感患者（n  =33）相比，TMZ耐药患者（n =36）的外泌体circ_0072083水平显着上调。此外，通过将这些外泌体暴露于不同条件来评估外泌体 circ_0072083 的稳定性，结果表明 TMZ 耐药患者中外泌体 circ_0072083 的丰度不受不同孵育时间和不同 pH 值的显着影响。此外，外泌体 circ_0072083 可以作为神经胶质瘤的独立诊断靶标（AUC= 0.85，P  < 0.05），并且外泌体 circ_0072083 水平高的患者总生存率较低（P  < 0.05）。 根据平均水平将患者分为高（n  = 36）或低（n = 33）外泌体circ_0072083组。桌子表格11总结出高外泌体circ_0072083水平与胶质瘤患者的肿瘤大小、晚期WHO分级、MGMT甲基化和TMZ抗性相关。这些发现表明外泌体circ_0072083在神经胶质瘤患者中具有重要作用。这表明外泌体circ_0072083可以通过在Warburg效应下调节ALKBH5介导的去甲基化来调节miR-1252-5p/NANOG轴来增加胶质瘤中的TMZ抗性。