外泌体miR-101-3p和miR-423-5p抑制成髓细胞瘤的发生

外泌体miRNAs与多种肿瘤的发展和进展有关。然而，它们是否有助于髓母细胞瘤(MB)的发生仍有待阐明。我们发现，与健康对照组相比，MB患者血浆分离的外泌体中有35个miRNA上调，5个miRNA下调。我们进一步发现，在扩大队列中，MB患者血浆外泌体中miR-101-3p和miR-423-5p的表达明显高于健康对照组，这些外泌体miRNAs可以通过外泌体传递到肿瘤细胞。miR-101-3p和miR-423-5p的体外功能分析表明，用相应的模拟物处理MB细胞可显著抑制肿瘤细胞的增殖、集落形成能力、迁移能力和侵袭能力，促进细胞凋亡。此外，miR-101-3p和miR-423-5p被发现通过直接靶向一个共同的基因FOXP4。miR-101-3p还靶向组蛋白甲基转移酶EZH2，增强其抑瘤作用。利用MB裸鼠异种移植模型，我们进一步发现miR-101-3p和miR-423-5p过表达抑制了体内肿瘤的发生。该文于2021年7月发表于Cell Death & Differentiation（IF= 15.828）杂志上。

技术路线

结果

1）MB患者血浆来源的外泌体中miR-101-3p和miR-423-5p水平上调，这些miRNA可通过外泌体转移到肿瘤细胞中

在初步筛选中，使用超离心法从MB患者和健康对照组的血浆中分离出外泌体。通过透射电子显微镜分析分离出的外泌体，确定外泌体的平均大小和形态，显示出典型的直径<150 nm的双层球形结构(图1A)。为了进一步验证我们的外泌体制剂，我们通过western blot检测了外泌体标志物CD9、CD63和GM130的表达。分离的颗粒外泌体核心蛋白标记CD9和CD63阳性，GM130阴性(图1B)。此外，我们通过miRNA-seq研究了血浆外泌体的miRNA表达谱。我们发现与健康对照组相比，MB患者中有35个miRNA上调，5个miRNA下调(图1C)。研究发现，MB患者血浆来源的外泌体中miR-101-3p、miR-320b-3p、miR-20a-5p和miR-423-5p的表达高于健康对照组血浆来源的外泌体(图1 D)。然后，我们通过qPCR检测了扩展队列中差异表达的miRNA的表达水平。与健康对照组相比，MB患者血浆来源的外泌体中miR-101-3p和miR-423-5p的表达上调(图1E)。我们还比较了MB患者和健康对照组外周血单个核细胞中miR-101-3p和miR-423-5p的表达，发现MB患者外周血单个核细胞中miR-101-3p和miR-423-5p的表达水平更高(图1F)。外周血来源的外泌体可被肿瘤细胞内化（图1G，1H）。总之，这些结果表明miR-101-3p和miR-423-5p在来源于MB患者血浆的外泌体中富集，并且可以通过这些外泌体输送到肿瘤细胞。

2）MiR-101-3p和MiR-423-5p在体外MB细胞中作为肿瘤抑制因子发挥作用

我们使用CCK-8分析了miR-101-3p和miR-423-5p对MB细胞增殖能力的影响。与对照组相比，Daoy和D283 Med细胞中miR-101-3p或miR-423-5p的过表达导致肿瘤细胞增殖率降低（图2A，B）。通过CCK-8分析，我们进一步评估了添加来自MB患者血浆的外泌体对Daoy和D283 Med细胞增殖的影响，结果表明，两种细胞系的肿瘤细胞的增殖能力均受到显著抑制（图2C）。接下来，我们研究了miR-101-3p和miR-423-5p对细胞凋亡的影响。与阴性对照组相比，任一miRNA的过表达都导致Daoy和D283 Med细胞的凋亡率显著增加（图2D，E）。此外，miR-101-3p或miR-423-5p的过表达抑制Daoy细胞的侵袭和迁移能力（图2F-H）。综上所述，这些数据证实miR-101-3p和miR-423-5p在MB细胞中均发挥抗肿瘤作用，并且任一miRNA的上调均可抑制MB细胞增殖、迁移和侵袭，同时也可促进细胞凋亡。

3）单核细胞/巨噬细胞来源的外泌体miR-101-3p和miR-423-5p可转移到MB细胞中

我们发现miR-101-3p和miR-423-5p在从MB患者血浆分离的PBMC和外泌体中均上调（图1E，F），而这两种miRNA在肿瘤组织中的表达低于相邻正常脑组织（图3A）。这表明含有这两种miRNA的外泌体来源于免疫细胞，而不是肿瘤细胞。为了确定含有miR-101-3p和miR-423-5p的外泌体的来源，我们从THP-1单核细胞培养上清液中分离外泌体，并检测miR-101-3p和miR-423-5p的表达。我们发现miR-101-3p和miR-423-5p在分离的外泌体中的表达高于THP-1细胞（图3B）。然后，我们用来源于转染miR-101-3p/miR-423-5p模拟物或miR-NC的THP-1细胞的外体培养Daoy细胞，并且观察到这些外泌体也可以转移到Daoy细胞中，培养后miR-101-3p和miR-423-5p的表达水平更高（图3C，D）。与对照组相比，来自转染miR101/miR-423模拟物的THP-1细胞上清液的外泌体显著抑制Daoy细胞的增殖能力（图3E）。我们用转染miR-101-3p/miR-423-5p的THP-1单核细胞培养上清液进一步培养Daoy细胞，发现Daoy细胞的增殖能力受到显著抑制，而在含GW4869的培养基中培养后则无明显变化（图3F）。这些结果表明，对细胞增殖的影响至少部分归因于外泌体的存在，并且GW4869处理可部分逆转这些影响。与THP-1细胞类似，我们发现HMO6细胞也能分泌含有miR-101-3p和miR-423-5p的外泌体， MB组织中存在CD68+细胞（图3G）。最后，我们从MB患者和健康对照者的外周血中分离CD14单核细胞。与对照组相比，在MB患者来源的CD14单核细胞培养上清中，外体miR-101-3p和miR-423-5p的表达更高（图3H）。总之，这些结果表明MB患者的单核细胞-巨噬细胞分泌含有miR-101-3p和miR-423-5p的外泌体，这些外泌体可以转移到MB细胞。

4）FOXP4是miR-101-3p和miR-423-5p的靶点

为了进一步了解miR-101-3p和miR-423-5p如何影响肿瘤进展，我们使用TargetScan和RNA22预测工具确定了它们的潜在靶点。我们选择了6个在两个数据库中均被miRNA调控的基因作为潜在靶点进行评估，分别是FOXP4、PLCB1、ANKRD52、ANGPTL2、DLGAP3、a和DCUN1D3(图4A)。由于FOXP4已知在胚胎发育和肿瘤发生中有作用，因此选择该基因进行进一步研究。经western blotting检测，转染miR-101-3p或miR-423-5p的Daoy细胞显示内源性FOXP4蛋白表达降低(图4B, C)。此外，HEK293T细胞中的荧光素酶报告基因检测显示，这两种miRNA的过表达均显著抑制FOXP4-3'UTR驱动的荧光素酶活性。然而，miR-101-3p或miR-423-5p与FOXP4 3'UTR共转染后，荧光素酶活性未见显著变化(图4D)。这表明FOXP4可能是MB中miR-101-3p和miR423-5p的直接和功能靶点。

5）FOXP4在MB细胞中起致癌基因的作用

我们首先通过qPCR检测FOXP4在MB肿瘤组织中的表达水平。FOXP4在MB肿瘤组织中的表达水平高于相邻脑组织样本(图5A)。为了进一步阐明靶向FOXP4是否可以介导MB肿瘤进展，我们在Daoy细胞中进行了一系列功能检测。使用siRNA抑制FOXP4表达(图5B)导致细胞增殖、迁移和侵袭减少，而细胞凋亡率增加(图5C-H)。这些结果强烈表明沉默FOXP4表型复制了miR-101-3p和miR-423-5p过表达对肿瘤进展的抑制作用。综上所述，这些结果表明FOXP4可能是MB肿瘤发生中的致癌基因。

6）EZH2在MB肿瘤组织中上调，是miR-101-3p的功能靶点，在MB肿瘤进展中作为癌基因

如图6A所示，肿瘤组织中EZH2 mRNA相对表达量明显高于癌旁正常组织。我们还利用TargetScan数据库研究了miR-101-3p在EZH2 3'UTR中是否存在匹配位点，并采用双荧光素酶报告基因检测证实了miR-101-3p与EZH2表达水平的相关性。转染miR-101-3p mimic降低了由野生型EZH2 3’UTR驱动的荧光素酶活性，而转染突变型后未见显著变化（图6B）。瞬时转染miR-101-3p也降低了在Daoy细胞中EZH2的mRNA和蛋白水平(图6C, D)。接下来，为了研究EZH2在MB中的功能，我们使用siRNA下调其在Daoy细胞中的表达(图6E)。功能检测显示，EZH2的下调抑制MB细胞活力、迁移和侵袭，同时促进MB细胞凋亡(图6F-K)。综上所述，这些结果表明miR-101-3p可以直接靶向EZH2和FOXP4抑制MB。

7）miR-101-3p或miR-423-5p过表达抑制体内肿瘤的发生

为了评价miR-101-3p和miR423-5p在体内的抗肿瘤作用，我们将转染LV16-miR-101-3p、LV16-miR-423-5p或LV16-NC的Daoy细胞皮下注射Balb/c雄性裸鼠。RT-qPCR检测miR-101-3p和miR-423-5p在慢病毒转染的Daoy细胞中的相对表达水平(图7A)。肿瘤在注射后2周被发现，小鼠在植入后7周被处死(图7B, C)。与对照组相比，LV16-miR-101-3p-和LV16-miR-423-5p处理组的肿瘤生长明显受到抑制(图7C, D)。如图7E所示，miR-101-3p或miR- 423-5p治疗后，肿瘤重量也显著降低。免疫组化检测EZH2、FOXP4和Ki67在异种移植瘤组织中的表达。在表达LV16-miR-101-3p-和LV16-miR-423-5p的肿瘤组织中FOXP4和Ki-67的水平均下调 (图7F, G)，而在LV16-miR-101-3p组EZH2也下调。这些数据表明，miR-101-3p和miR-423-5p通过抑制FOXP4和EZH2的表达，在体内抑制肿瘤生长。

   结论：我们鉴定了两种外泌体miRNAs, miR-101-3p和miR-423-5p，在体外和体内均是MB细胞增殖、迁移和凋亡的关键调控因子，并确定这些作用是通过与FOXP4 3'UTR直接结合而发挥的。我们进一步发现miR-101-3p也可以靶向EZH2。我们的数据为MB的治疗提供了一种新的治疗策略。