CircMAPK14编码多肽——抑制肿瘤
众所周知，MAPK信号通路和肿瘤进展密切相关，其中MAPK14是该通路上调控结直肠癌（CRC）进展的重要分子模块。近来，也有不少研究表明circRNA可以编码多肽，但是circMAPK14是否具有翻译功能又在CRC中扮演何种作用仍然未知。本研究对此进行了探讨，发现CircMAPK14是一个可编码的肿瘤抑制因子。本文于2021年10月发表在《Clinical and Translational Medicine》IF:11.492期刊上。
技术路线：
主要结果：
作者首先从circRNADb数据库中筛选到了4个来源于MAPK14分子的circRNAs，结果发现只有(hsa_circ_24603在72对CRC组织中显著上调，将其命名为circMAPK14，其低表达与CRC肿瘤不良预后相关，且在多个CRC细胞系中显著下调表达。研究显示circMAPK14来源与MAPK14的外显子4至10的片段背向剪切而成，全长536nt，并主要定位在细胞质中。
图1 CRC组织和细胞系中circMAPK14的鉴定和特征
2、circMAPK14抑制CRC的增殖和迁移
接下来作者研究了circMAPK14的生物学功能，如图2，结果显示过表达circMAPK14会显著抑制CRC细胞系的增殖，集落形成，迁移和侵袭，同时促进癌细胞凋亡。
图2 CircMAPK14抑制CRC细胞的增殖和迁移
3、circMAPK14在CRC中编码一种新蛋白
基于上述circRNADb数据库分析，作者发现circMAPK14包含一个开放阅读框和一个IRES序列，可能编码一个175个氨基酸的蛋白（命名为circMAPK14-175aa），如图3A所示。随后为验证其编码蛋白的活性，将IRES的两个不同区域突变掉（图3B），发现IRES突变体1显著降低了荧光素酶活性，但突变体2没有影响（图3C）。circMAPK14-175aa多肽序列包含一段MAPK14的同源片段，该片段包含一个特殊的C末端‘Gly Ile Trp’（GIW）序列，并且作者发现了一种针对MAPK14中间段的抗体(aa 150-250)，它能同时识别MAPK14和circMAPK14-175aa。随后作者进一步探究了circMAPK14-175aa的IRES活性，发现circMAPK14编码175 aa蛋白，分子量为20 kDa，由IRES序列在核苷酸288-427处驱动（图3E）。之后将circMAPK14过表达载体和IRES突变体1载体同时转染至CRC细胞，银染和LC-MS/MS结果显示一个特殊序列，FANVFIGANPLGIW，它包含一段C末端有GIW的氨基酸序列，这和前面的研究结果一致，且同样的结果在WB中也发现了（图3F-H）。在CRC细胞系和组织中， 这175aa的表达水平都显著低于对照组，而过表达或敲除这175aa，都不能改变MAPK14的蛋白水平（图3I-J）。这些结果表明这175个氨基酸是由circMAPK14编码而来。
图3 CircMAPK14编码175个氨基酸的新蛋白质，称为circMAPK14 -175aa
4、circMAPK14抑制CRC细胞的恶性表型是通过circMAPK14 -175aa
为了进一步评估circMAPK14在CRC中生物学功能是否通过编码蛋白，作者将以下载体转染至两株CRC细胞系中：circMAPK14-ov，circMAPK14 ATG mut，circMAPK14 IRES mut，线性化的175aa-ov，和circMAPK14-sh#1。上述载体都没有影响MAPK14的表达。结果如图4所示，circMAPK14-ov和线性化的175aa-ov都能显著抑制CRC细胞的生物学功能，但是和circMAPK14-ov组相比，circMAPK14 ATG mut，circMAPK14 IRES mut的生物学功能没有显著回复，表明circMAPK14抑制CRC细胞的恶性表型是通过circMAPK14 -175aa。
图4 CircMAPK14体外通过175aa抑制CRC恶性表型
5、circMAPK14缓解肿瘤生成和转移是通过circMAPK14 -175aa
之后作者进一步在体内探究了circMAPK14 -175aa多肽是否具有生物活性。这里是将circMAPK14-ov和线性化的175aa-ov的细胞系接种至小鼠，结果如图5所示，这两种方式都能显著抑制小鼠的肿瘤体积和重量，以及肺转移和肝脏转移。表明circMAPK14编码的多肽175aa-ov承载了缓解肿瘤生长的生物学功能。
图5 CircMAPK14在体内通过175aa降低CRC的致瘤性和转移
6、circMAPK14-175aa抑制MAPK14的磷酸化通过竞争性结合MKK6
为了探究circMAPK14 -175aa调控的潜在机制，作者将Flag-tagged circMAPK14 -175aa转染至HEK193T细胞，进行免疫沉淀（IP）实验。作者通过IP裂解物的MS结果鉴定到MKK6蛋白可能与circMAPK14-175aa结合。Flag标记的circMAPK14-175aa可以和MKK6相互作用，并具有细胞质共定位（图6A-C）。此前有研究表明激活上游激酶MKK6可以磷酸化MAPK14，当MAPK14被磷酸化，它就会被转移至细胞核从而阻断FOXC1的降解。由于circMAPK14-175aa和MAPK14共享序列包含其磷酸化识别位点，所以作者猜测circMAPK14-175aa可能可以结合MKK6。因此，进行了co-IP实验，结果显示上调circMAPK14增加了circMAPK14-175aa和MKK6的绑定程度，但是降低了MAPK14和MKK6之间的结合（图6D）。这些结果表明circMAPK14-175aa通过竞争性结合MKK6来抑制MAPK14的磷酸化。
随后，作者进一步证实改变circMAPK14表达后FOXC1的mRNA和蛋白表达水平，如预期地，FOXC1的蛋白水平随着circMAPK14表达的改变而改变，但是mRNA水平不受影响（图6E-F）。作者用蛋白合成抑制剂CHX处理CRC细胞，发现circMAPK14促进FOXC1蛋白的降解，缩短其半周期（图6G）。为了确定降低circMAPK14的表达是否通过抑制泛素化来维持FOXC1蛋白的稳定性，将Myc-FOXC1和HAUb共转染到稳定转染circMAPK14的CRC细胞中，研究发现，过表达circMAPK14可增强FOXC11的泛素化（图6I）。FOXC1的下游靶基因也发生了相应的变化，包括SOX4、SOX13和MMP10（图6J）。总的来说，这些数据表明，circMAPK14编码的circMAPK14-175aa通过抑制MAPK14核易位促进FOXC1降解，而不是直接与FOXC1结合。
图6 CircMAPK14-175aa通过与MKK6竞争抑制MAPK14的磷酸化，随后通过泛素化促进FOXC1的降解
总之，本研究表明circMAPK14- 175aa由circMAPK14编码，依赖于其ORF和IRES序列。circMAPK14- 175aa通过与MKK6竞争性结合抑制MAPK14的磷酸化，从而抑制MAPK14的核转位。此外，circMAPK14-175aa加速了泛素介导的FOXC1降解，抑制了CRC的进展和转移。此外，CRC中FOXC1升高是circMAPK14-175aa表达减少所致。反过来，这通过抑制U2AF2的转录降低了circMAPK14的循环效率，形成了一个正反馈回路来调节CRC中的circMAPK14（图7）。
图7 circMAPK14编码的circMAPK14-175aa与MKK6竞争抑制CRC的致瘤性和转移的机制图
参考文献：
Wang, L, Zhou, J, Zhang, C, et al. A novel tumour suppressor protein encoded by circMAPK14 inhibits progression and metastasis of colorectal cancer by competitively binding to MKK6. Clin Transl Med. 2021; 11:e613. https://doi-org.washington.80599.net/10.1002/ctm2.613