外泌体miR-101-3p和miR-423-5p通过靶向FOXP4和EZH2抑制成髓细胞瘤的发生

外泌体microRNAs (miRNAs)与多种肿瘤的发展和进展有关；然而，它们是否于髓母细胞瘤(MB)的发生仍有待阐明。在此，有研究发现外泌体miR-101-3p和miR-423-5p在儿童MB的发病中起重要作用，该研究于2021年7月发表在《Cell Death and Differentiation》，IF：15.828。

技术路线：

主要研究结果：

1.       MB患者血浆来源的外泌体中miR-101-3p和miR-423-5p水平上调，这些miRNA可通过外泌体转移到肿瘤细胞中

在初步筛选中，使用超离心法从MB患者(n = 4)和年龄匹配的健康对照组(n = 4)的血浆中分离出外泌体。通过透射电子显微镜分析分离出的外泌体，以确定外泌体的平均大小和形态，显示出典型的直径为150 nm的双层球形结构(图1A)。通过western blot检测了外泌体标志物CD9、CD63和GM130的表达。分离的颗粒外泌体核心蛋白标记CD9和CD63阳性，顺式高尔基标记GM130阴性(图1B)。

通过miRNA-seq研究了血浆外泌体的miRNA表达谱。使用1.5倍的变化作为阈值来定义上调或下调的miRNA，与健康对照组相比，MB患者中有35个miRNA上调，5个miRNA下调(图1C)。然后选择p值<0.05进一步缩小差异miRNAs的表达范围，发现MB患者血浆来源的外泌体中miR-101-3p、miR-320b-3p、miR-20a-5p和miR-423-5p的表达高于健康对照组血浆来源的外泌体(图1D)。通过实时定量PCR (qPCR)检测了miRNA的表达水平。与健康对照组相比，MB患者血浆来源的外泌体中miR-101-3p和miR-423-5p的表达上调(图1E)。另外，比较了MB患者和健康对照组外周血单个核细胞中miR-101-3p和miR-423-5p的表达，发现MB患者外周血单个核细胞中miR-101-3p和miR-423-5p的表达水平更高(图1F)。

为了确定血浆来源的外泌体是否能转移到受体肿瘤细胞，用从MB患者分离的PKH67标记的外泌体培养Daoy（MB细胞系）细胞24小时。随后的共聚焦显微镜分析证实癌细胞细胞质中存在PKH67标记的外泌体，这意味着外周血来源的外泌体可被肿瘤细胞内化（图1G）。在使用来源于MB患者血浆的混合外泌体培养Daoy细胞后，miR-101-3p和miR-423-5p的表达水平均上调，而使用来源于健康对照血浆的外泌体培养后，未观察到显著变化（图1H）。这些结果表明，miR-101-3p和miR-423-5p在来源于MB患者血浆的外泌体中富集，并可通过这些外泌体输送到肿瘤细胞。

2. miR-101-3p和miR-423-5p在MB细胞中具有抑癌作用

使用CCK-8分析了miR-101-3p和miR-423-5p对MB细胞增殖能力的影响。与对照组相比，Daoy和D283 Med细胞中miR-101-3p或miR-423-5p的过度表达导致肿瘤细胞增殖率降低（图2A，B）。通过CCK-8分析，进一步评估了添加来自MB患者血浆的外泌体（50μg/ml）对Daoy和D283 Med细胞增殖的影响，结果表明，两种细胞系的肿瘤细胞的增殖能力均受到显著抑制（图2C）。通过流式细胞术分析研究了miR-101-3p和miR-423-5p对细胞凋亡的影响。与阴性对照组相比，任一miRNA的过度表达导致Daoy和D283 Med细胞的凋亡率显著增加（图2D，E）。

迁移和侵袭实验发现，miR-101-3p或miR-423-5p的过度表达抑制Daoy细胞的侵袭和迁移能力（图2F-H）。综上所述，这些数据证实miR-101-3p和miR-423-5p在MB细胞中发挥抗肿瘤作用，并且miRNA的上调可以抑制MB细胞增殖、迁移和侵袭，同时也促进细胞凋亡。

3. 单核细胞/巨噬细胞来源的外泌体miR-101-3p和miR-423-5p可转入MB细胞

前面发现miR-101-3p和miR-423-5p在MB患者血浆分离的PBMCs和外泌体中均上调(图1E, F)，而这两种miRNAs在肿瘤组织中的表达均低于相邻正常脑组织(图3A)。这表明含有这两种mirna的外泌体来自免疫细胞而不是肿瘤细胞，是对肿瘤的免疫反应的结果。巨噬细胞来源的外泌体占血液中循环微泡的很大比例。为了确定含有miR-101-3p和miR-423-5p的外泌体的来源，从THP-1单核细胞培养上清中分离出外泌体，并检测miR-101-3p和miR-423-5p的表达。发现miR-101-3p和miR-423-5p在分离的外泌体中的表达高于THP-1细胞(图3B)。用转染miR-101-3p/miR-423-5p模拟物或miR-NC的THP-1细胞衍生的外泌体培养Daoy细胞，观察到这些外泌体也可以转移到Daoy细胞中，并且培养后miR-101-3p和miR-423-5p的表达水平较高（图3C，D）。与对照组相比，来自转染miR-101/miR-423模拟物的THP-1细胞上清液的外泌体显著抑制Daoy细胞的增殖能力（图3E）。进一步用转染miR-101-3p/miR-423-5p模拟物或miR-NC（阴性对照）的THP-1单核细胞培养上清液培养Daoy细胞，发现Daoy细胞的增殖能力受到显著抑制，而用含有GW4869的培养基培养后未观察到显著变化（40μM；一种抑制外泌体分泌的中性鞘磷脂酶抑制剂）（图3F）。这些结果表明，对细胞增殖的影响至少部分是由于外泌体的存在，并且这些影响可以通过GW4869处理部分逆转。与THP-1细胞类似， HMO6细胞也可以分泌含有miR-101-3p和miR-423-5p的外泌体（图S4A D）和存在于MB组织中的CD68+细胞（图3G）。从MB患者和健康对照组的外周血中分离出CD14+单核细胞，并将其培养72小时。与对照组相比，MB患者来源的CD14+单核细胞培养上清液中的外体miR-101-3p和miR-423-5p的表达更高（图3H）。总之，这些结果表明MB患者的单核巨噬细胞分泌含有miR-101-3p和miR-423-5p的外泌体，这些外泌体可以转移到MB细胞。

4. FOXP4是miR-101-3p和miR-423-5p的靶点

使用TargetScan和RNA22预测工具确定了它们的潜在靶点。确定了6个在两个数据库中均被miRNA调控的基因作为潜在靶标进行评估，分别是FOXP4、PLCB1、ANKRD52、ANGPTL2、DLGAP3和DCUN1D3(图4A)。由于FOXP4 (forkhead box P4)已知在胚胎发育和肿瘤发生中有作用，因此选择该基因进行进一步研究。经western blotting检测，转染miR-101-3p或miR-423-5p的Daoy细胞显示内源性FOXP4蛋白表达降低(图4B, C)。此外，HEK293T细胞中的荧光素酶报告基因检测显示，这两种miRNA的过表达均显著抑制FOXP4-3’UTR驱动的荧光素酶活性；然而，miR-101-3p或miR-423-5p与突变的FOXP4-3’UTR共转染后，荧光素酶活性未见显著变化(图4D)。这表明FOXP4可能是MB中miR-101-3p和miR- 423-5p的直接和功能靶点。

5. FOXP4在MB细胞中起致癌基因的作用

通过real-time qPCR检测发现FOXP4在MB肿瘤组织中的表达水平高于相邻脑组织样本(图5A)。为了进一步阐明靶向FOXP4是否可以介导MB肿瘤进展，在Daoy细胞中进行了一系列功能检测。使用siRNA抑制FOXP4表达(图5B)导致细胞增殖、迁移和侵袭减少，而细胞凋亡率增加(图5C-H)。综上所述，这些结果表明FOXP4可能是MB肿瘤发生中的致癌基因，并且可能是miR-101-3p和miR-423-5p的靶点。

6. EZH2在MB肿瘤组织中上调，是miR-101-3p的功能靶点，在MB肿瘤进展中作为癌基因

由于在体外观察到miR-101-3p对Daoy细胞的抑制作用似乎强于miR-423-5p(图2A)。这提示miR-101-3p也可能靶向FOXP4以外的基因。通过生物信息学分析，发现EZH2是miR-101-3p的另一个假定靶点。

如图6A所示，肿瘤组织中EZH2 mRNA的相对表达显著高于邻近正常组织。TargetScan数据库中调查处EZH2 3’-UTR中存在miR-101-3p的匹配位点，并采用双荧光素酶报告子分析来确认miR-101-3p和EZH2表达水平之间的相关性。如图6B所示，miR-101-3p模拟物的转染降低了野生型EZH2 3’-UTR驱动的荧光素酶活性，而在以突变形式转染后未观察到显著变化，这表明miR-101-3p可以通过直接结合其3’-UTR中的位点来抑制EZH2的表达。瞬时转染miR-101-3p也降低了Daoy细胞中EZH2 mRNA和蛋白质水平（图6C，D）。

接下来，为了研究EZH2在MB中的功能，同样使用siRNA敲除其在Daoy细胞中的表达(图6E)。功能分析显示，EZH2的下调抑制MB细胞活力、迁移和侵袭，同时促进MB细胞凋亡(图6F-K)。综上所示，这些结果表明，miR-101-3p可以直接靶向EZH2和FOXP4抑制MB。

7.     miR-101-3p或miR-423-5p过表达抑制体内肿瘤的发生

为了评估miR-101-3p和miR-423-5p在体内的抗肿瘤作用，将转染LV16-miR-101-3p、LV16-miR-423-5p或LV16-NC（阴性对照）的Daoy细胞（5 106）皮下注射到雄性Balb/c裸鼠体内，并每周测量产生的肿瘤体积。通过RT-qPCR测定转染慢病毒的Daoy细胞中miR-101-3p和miR-423-5p的相对表达水平（图7A）。注射后2周可触及肿瘤，植入后7周处死小鼠（图7B，C）。与对照组相比，LV16-miR-101-3p和LV16-miR-423-5p治疗组的肿瘤生长受到显著抑制（图7C，D）。如图7E所示，使用miR-101-3p或miR-423-5p治疗后，肿瘤重量也显著降低。通过免疫组织化学评估了EZH2、FOXP4和Ki-67在异种移植肿瘤组织中的表达。与对照组织相比，表达LV16-miR-101-3p和LV16-miR-423-5p的肿瘤组织中FOXP4和Ki-67的水平均下调（图7F，G），而表达LV16-miR-101-3p的肿瘤组织中EZH2的水平也下调。总之，这些数据表明miR-101-3p和miR-423-5p通过抑制FOXP4和EZH2的表达来抑制体内肿瘤生长。

 主要结论：

综上所述，作者确定了两种外泌体的miRNAs， miR-101-3p和miR-423-5p在体外和体内均是MB细胞增殖、迁移和凋亡的关键调控因子，并确定这些作用是通过与FOXP4-3’UTR直接结合而发挥的。进一步发现miR-101-3p也可以靶向EZH2。这些数据为MB的治疗提供了一种新的治疗策略(图8)。