M6A RNA甲基化介导的RMRP稳定性导致非小细胞肺癌的增殖和进展

在全球所有恶性肿瘤中，非小细胞肺癌(NSCLC)的死亡率最高。 lncRNA在肿瘤进展中的作用是当前的研究热点。基于TCGA数据库的综合分析，我们发现RMRP是与NSCLC低生存率相关的最高上调的lncRNA之一。此外，m6A在RMRP内高度富集，增强了其RNA稳定性。体外和体内实验表明，RMRP可促进NSCLC细胞增殖、侵袭和迁移。在机制上，RMRP将YBX1招募到TGFBR1启动子区域，导致TGFBR1的转录上调。TGFBR1/SMAD2/SMAD3通路也受RMRP调控。此外，RMRP促进了肿瘤干细胞特性和上皮间充质转化，从而促进了对放疗和顺铂的耐药。临床资料进一步证实RMRP与TGFBR1呈正相关。我们的工作揭示了m6A RNA甲基化介导的RMRP稳定性通过调控TGFBR1/SMAD2/SMAD3通路而导致NSCLC的增殖和进展。本文于2021年10月发表在“Cell Death & Differentiation”（ IF:15.828）期刊上。

技术路线

结果

1）NSCLC的综合分析显示RMRP可能是一种生物标志物

我们对TCGA肺腺癌(LUAD)数据库进行了综合分析。与正常组织相比，RMRP在非小细胞肺癌组织中上调(图1A)。高RMRP表达与晚期T期和较差的生存率相关(图1B和C)。此外，在GSE43458中，与正常肺组织相比，非小细胞肺癌组织中RMRP表达上调，如图GEO数据库(图1D)所示。GO结果显示，RMRP在蛋白质异二聚活性、染色质DNA结合、苦味受体活性等方面发挥作用(图1E)。KEGG结果显示RMRP在酒精中毒、系统性红斑狼疮、病毒癌变、转录异常等途径富集(图1F)。然后进行KEGG研究的基因集富集分析(GSEA)。RMRP在细胞周期、结直肠癌、蛋白质输出、TGFB途径和泛素介导的蛋白水解途径中富集(图1G)。这些通路与肿瘤的发生和转移密切相关，提示RMRP可能在NSCLC中发挥重要作用。我们还对RMRP的蛋白编码潜能进行了探究，发现RMRP不具有蛋白编码潜能(图1H和I)。

2）m6A修饰在RMRP中富集，提高了RMRP的转录稳定性

最近的初步研究报道，m6A修饰广泛存在，通过调控转录组影响RNA的剪接、翻译、输出、定位和稳定性。为了探究m6A对RMRP的修饰，我们首先使用在线生物信息学工具m6Avar预测位于RMRP中的m6A位点，并鉴定出两个RMRP m6A序列基元。然后，在人肺上皮细胞(HBE)和两株NSCLC细胞株(A549和H1299)中进行甲基化RNA免疫沉淀(Me-RIP)检测。MeRIP-qPCR检测显示，HBE细胞中RMRP的m6A甲基化水平低于NSCLC细胞(A549和H1299)(图2A)。然后我们用小干扰RNA靶向m6A甲基化酶复合物的核心成分METTTL3，发现A549细胞中总RNA和RMRP RNA中的m6A水平都降低了(图2B, C, D)。放线菌素D 阻断A549细胞新RNA合成后，检测RMRP RNA的丢失情况。结果显示，METTL3下调后，RMRP表现出较低的RNA稳定性(图2E)。

3）RMRP促进NSCLC细胞增殖

为了进一步探讨RMRP的作用，我们采用定量RT-PCR方法检测RMRP在NSCLC细胞中的表达。RMRP在A549细胞中的表达明显高于H1299细胞(图3A)。因此，我们在A549细胞中转染了两种不同的抗RMRP shRNA (shRMRP-1和shRMRP-2)或对照组的shRNA (rash)，并在H1299细胞中转染了RMRP过表达质粒(RMRP)或对照的质粒。通过定量RT-PCR分析证实了转染效率(图3B和C)。CCK-8和菌落形成实验表明，转染了shRMRP的NSCLC细胞的生长和增殖受到了显著的抑制。而转染过表达RMRP的质粒后效果相反(图3D-G)。

4）TGFBR1是RMRP促进增殖、侵袭和迁移的关键靶点

在我们之前的研究中，我们发现TGFBR1与NSCLC的增殖和转移相关，GSEA结果显示RMRP可能参与了TGFB通路。TCGA数据库显示TGFBR1与RMRP表达呈正相关(图4A)。因此，我们假设RMRP可能以TGFBR1为靶点。此外，在A549或H1299细胞中，RMRP敲低或过表达后，TGFBR1的表达发生改变(图4B、C、D)。在A549细胞中，下调RMRP后，TGFBR1的表达降低，BAX/ Bcl-2升高，而TGFBR1过表达后，效果相反。在H1299细胞中，过表达RMRP后，TGFBR1的表达增加，BAX/Bcl-2的表达减少，而TGFBR1敲低后则相反(图4D)。此外，我们还探索了TGFBR1参与RMRP促进NSCLC生长和增殖的机制。结果显示，TGFBR1过表达后，shRMRP对NSCLC细胞生长和增殖的抑制作用得到恢复，而TGFBR1敲低后则相反(图4E, F, H, J)。

TGFBR1促进NSCLC细胞的侵袭、迁移和G1细胞周期进展。因此，我们探讨了RMRP对侵袭、迁移和G1细胞周期进程的影响。与对照组相比，转染shRMRP的NSCLC细胞显著抑制了侵袭、迁移和G1细胞周期进展，而在RMRP过表达的细胞中观察到相反的效果。在TGFBR1过表达后，，shRMRP对NSCLC细胞的侵袭、迁移和G1细胞周期进展的抑制作用被挽救，而在TGFBR1敲低后，观察到相反的效果(图4G, I, K, L, M，和N)。以上结果表明TGFBR1可能是RMRP促进增殖、侵袭和迁移的关键靶点。

5）RMRP与转录因子YBX1相关

为了进一步阐明RMRP的机制，我们在NSCLC细胞中进行了核和细胞质RNA的分离和荧光原位杂交(FISH)检测。结果显示，RMRP主要位于胞质(图5A和B)。最近的一些报道发现，许多lncRNA通过与DNA或蛋白质相互作用发挥作用。为了探讨RMRP的调控作用，我们使用catRAPID。结果显示，在NSCLC中发挥重要作用的YBX1是RMRP的潜在结合蛋白(图5C)。RIP实验显示，抗YBX1抗体显著富集了RMRP(图5D和E)。RNA下拉实验进一步证实了RMRP和YBX1之间的相互作用(图5F)。以上结果表明YBX1与RMRP之间存在密切的相互作用。

6）RMRP通过招募YBX1来促进TGFBR1的转录

我们探索TCGA-LUAD的ATAC-seq数据，以确定TGFBR1可能的转录因子。该分析揭示了TGFBR1基因启动子区可能存在的YBX1结合序列。在GEPIA的TCGA-LUAD数据库中，YBX1的表达与TGFBR1呈正相关，而与RMRP无相关性(图6A-C)。因此，我们推测YBX1是一个转录因子，可能被RMRP招募到TGFBR1启动子中。为了进一步研究其机制，我们分别转染siRNA (SiYBX1)、pcDNAYBX1 (YBX1)和它们匹配的对照(SiNC或Ctrl)。YBX1敲低抑制了TGFBR1的表达，而YBX1过表达则增加了TGFBR1的表达(图6D)。YBX1结合复合物显示TGFBR1启动子显著富集。YBX1过表达增加了TGFBR1-WT细胞中的荧光素酶活性 (图6G和H)。RMRP敲低降低了YBX1在TGFBR1启动子上的富集。共转染YBX1可逆转这一效应(图6I)。此外，RMRP增加了结合(图6J)。荧光素酶检测进一步显示，荧光素酶活性的变化是由于RMRP的敲减或过表达(图6K和L)。

7）RMRP调控NSCLC中TGFBR1/SMAD2/ SMAD3通路

TGFBR1/SMAD2/SMAD3通路在NSCLC中发挥重要作用。Western blot和免疫荧光检测显示，RMRP敲低显著抑制了NSCLC细胞中的核易位和p-SMAD2/ 3的表达(图7A和B)。RMRP的改变对siTGFBR1组中p-SMAD2和p-SMAD3的表达水平没有影响，这表明TGFBR1是RMRP激活SMAD2/SMAD3信号通路所必需的(图7C)。

TGFB通路常与CSC性质和EMT有关。因此，我们探讨了RMRP是否促进NSCLC中的CSC特性。我们通过qRT-PCR检测了CSC相关基因KLF4、SOX2、NANOG、CD133和ALDH的表达，发现在A549细胞中，RMRP敲低后这些基因的表达降低。在H1299细胞中，过表达RMRP后，这些基因表达上调(图7D)。此外，我们还进一步探索了这些细胞中EMT相关基因的表达。结果显示，RMRP敲低增加了E-Cadherin的表达，降低了N-Cadherin和Vimentin的表达(图7A)。我们还探索了这些细胞的成球能力。实验表明，RMRP敲低降低了成球能力，而过表达RMRP则增加了成球能力(图7E)。RMRP抑制增加了A549细胞对顺铂和放疗的敏感性(图7F和G)。这些数据表明，RMRP通过增强CSC自我更新和EMT促进NSCLC进展。

8）在体内抑制RMRP抑制肿瘤生长

为了进一步证实RMRP在体内促进肿瘤生长，将A549-shRMRP细胞和A549- scramble细胞注射到裸鼠体内。30天后，shRMRP组肿瘤明显变小(图8A和B)。shRMRP组肿瘤体积和重量显著降低（图8C，D）。此外，在A549-scramble中，Ki-67、MMP9和TGFBR1的表达更高（图8E）。

结论：m6A修饰促进了lncRNA-RMRP/TGFBR1/SMAD2/SMAD3通路。其潜在的机制是通过RMRP将转录因子YBX1招募到TGFBR1启动子，从而对TGFBR1进行转录调控。此外，RMRP增加了球形成能力和EMT，这与放疗和化疗的耐药有关。RMRP是一种生物标志物，在NSCLC中具有潜在的预后和治疗相关性。

参考文献：Yin H, Chen L, Piao S, Wang Y, Li Z, Lin Y, Tang X, Zhang H, Zhang H, Wang X. M6A RNA methylation-mediated RMRP stability renders proliferation and progression of non-small cell lung cancer through regulating TGFBR1/SMAD2/SMAD3 pathway. Cell Death Differ. 2021 Oct 9. doi: 10.1038/s41418-021-00888-8. Epub ahead of print. PMID: 34628486.