LncRNA MELTF-AS1调节MMP14的表达促进骨肉瘤转移
骨肉瘤是一种高度侵袭性的癌症，常见于儿童和青少年。对于转移性或复发性骨肉瘤仍然缺乏有效的治疗方法。本研究报道了一种新的lncRNA在骨肉瘤转移中的关键作用，其有作为靶向治疗的潜在靶点。本文发表在《Molecular Therapy Nucleic Acids》IF：8.886的2021年12月刊上。
技术路线：
主要实验结果：
1、lncRNA MELTF-AS1在骨肉瘤中上调，并与骨肉瘤的远处转移有关
如图1所示，作者分析TARGET数据库骨肉瘤的转录组数据，鉴定了转移组织和非转移肿瘤组织的差异表达lncRNA，此外，MELTF-AS1的表达，与正常组织相比，在肿瘤中高表达；与非转移的肿瘤组织相比，在远端转移组织中高表达；MELTF-AS1高表达和不良预后相关；它同时在多个骨肉瘤细胞系中高表达，但是在尤文氏肉瘤细胞系中却没有高表达，表明其特异性。
图1 lncRNA MELTF-AS1在骨肉瘤中上调并与骨肉瘤的远处转移有关
随后作者为何MELTF-AS1的表达在骨肉瘤中升高。使用JASPAR数据库预测了可能与MELTF-AS1启动子结合的转录因子，其中RREB1的预测得分最高，而沉默RREB1之后，MELTF-AS1的表达显著减少，过表达则相反（图2A-B）。此外，RREB1的表达在远端转移组织中最高，其次是未转移肿瘤，最后是正常组织，免疫组化可以清晰展示这一点（图2C-D）。RREB1抗体的染色质免疫沉淀(ChIP)实验表明，它可以直接结合MELTF-AS1的启动子区域（图2E）。荧光素酶报告基因实验表明，当RREB1过表达是，荧光素酶活性显著增加，但是当RREB1和启动子结合区域敲除后，过表达RREB1也不能改变荧光素酶活性（图2F）。这些表明RREB1激活骨肉瘤中MELTF-AS1的转录。
图2 RREB1结合MELTF-AS1的启动子激活其转录
3、MELTF-AS1促进骨肉瘤的体内外转移
如图3所示，干扰MELTF-AS1的表达，抑制骨肉瘤细胞的体外转移和体内肿瘤的转移，表现为转移结节减少，转移标志物表达下降，且敲除MELTF-AS1后小鼠的总体生存率显著提高。这些结果表明MELTF-AS1可促进骨肉瘤的体内外转移。
4、MELTF-AS1在骨肉瘤中以ceRNA机制调控miR-485-5p
FISH和亚细胞分离的qRT-PCR分析结果显示MELTF-AS1主要定位在细胞质中（图4A-B），因此，推测其可能作为ceRNA发挥功能，预测了可能具有潜在结合关系的miRNA并进行生物素标记MELTF-AS1探针的RNA pull-down实验。结果如图4C所示，miR-485-5p和miR-665可以与MELTF-AS1直接结合，但因为前者的结合丰度更高，所以选择miR-485-5p进行实验。如预期地，沉默MELTF-AS1后miR-485-5p的表达显著升高，过表达则相反（图4D-E），RNA IP结果显示MELTF-AS1和miR-485-5p都可以和AGO2蛋白直接结合，并且荧光素酶实验的结果也表明两者具有直接结合关系（图4F-G）。此外，miR-485-5p在骨肉瘤组织中的表达与MELTF-AS1完全相反，和正常组织相比，在非转移性肿瘤组织中下调表达，在远端转移的组织中进一步显著下调表达。以上结果表明MELTF-AS1在骨肉瘤中以ceRNA机制调控miR-485-5p。
图4 miR-485-5p是MELTF-AS1的一个靶点
5、MELTF-AS1通过与miR-485-5p的相互作用调控MMP14的表达
通过生物信息学分析发现转移相关蛋白MMP14是miR-485-5p的一个靶基因，荧光素酶实验证实两者间具有直接结合关系（图5A）。而沉默MELTF-AS1会显著下调MMP14的表达，而当MELTF-AS1沉默和miR-485-5p的抑制剂共同作用时MMP14的表达回复到接近正常水平（图5B）。此外，过表达MELTF-AS1会导致MMP14的表达升高，但是与miR-485-5p同时过表达，则MMP14表达升高的趋势被抑制（图5C-D）。进一步分析发现MMP14的表达和MELTF-AS1的表达正相关，和miR-485-5p的表达负相关。总之，MELTF-AS1吸附细胞质中miR-485-5p的表达，以ceRNA机制促进MMP14表达。
图5 MELTF-AS1通过与miR-485-5p的相互作用调控MMP14的表达
6、MELTF-AS1通过调节MMP14促进骨肉瘤转移
如图6所示，过表达MELTF-AS1增加了骨肉瘤细胞的转移和迁徙，和转移标志物分子的表达，但是在过表达MELTF-AS1的同时，过表达miR-485-5p或者抑制MMP14的表达，则显著减少了这种转移能力的能加。表明MELTF-AS1是通过调节MMP14促进骨肉瘤转移。
图6 MELTF-AS1表现出部分依赖于MMP14的促转移特性
总之，如图7所示，转录因子RREB1激活MELTF-AS1的转录，其海绵吸附miR-485-5p进而上调靶基因MMP14的表达，导致骨肉瘤细胞转移能力的获得。
图7 本研究的机制模型图
参考文献：
Ding Lei., Liu Taiyuan., Qu Yuan., Kang Zhichen., Guo Lixin., Zhang Haina., Jiang Junjie., Qu Fuling., Ge Wanbao., Zhang Shanyong.(2021). lncRNA MELTF-AS1 facilitates osteosarcoma metastasis by modulating MMP14 expression. Mol Ther Nucleic Acids, 26(undefined), 787-797. doi:10.1016/j.omtn.2021.08.022