顺式作用lnc-Cxcl2抑制中性粒细胞介导的病毒感染性肺炎
病毒感染过程中上皮细胞产生的趋化因子对于中性粒细胞的招募非常重要，适当的调节趋化因子产生对于限制炎症和减缓随后的组织损伤非常重要。在病毒感染和炎症过程中，上皮细胞lncRNA、RNA结合蛋白的表达及其功能相互作用尚不清楚。本文发现lnc-Cxcl2顺式作用通过抑制病毒感染中上皮细胞CXCL2的表达来抑制中性粒细胞介导的肺炎。该于2021年10月发表在《Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States》IF：9.58期刊上。
技术路线：
主要实验结果：
1、lnc-Cxcl2的表达在小鼠肺上皮细胞核中上调表达以响应病毒感染
首先，作者通过文献确定了趋化因子CXCL2为研究目前，然后通过RNA测序筛选到顺式调节CXCL2的lncRNA，将其命名为lnc-Cxcl2。首先检测了lnc-Cxcl2的表达，如图1A-D所示，和测序结果一致，lnc-Cxcl2在肺上皮细胞系中的表达响应病毒感染，并和CXCL2的mRNA表达趋势一致。并且用WB检测到了其转录本的表达（图1E）。原位杂交显示随着病毒感染延长，lnc-Cxcl2在核中的组分逐渐增加（图1F）。NF-κB inhibitor处理后，CXCL2的mRNA表达和lnc-Cxcl2的表达都显著下降了（图1H-G）。表明lnc-Cxcl2是一个核lncRNA，通过NF-κB信号通路响应病毒感染。
图1 lnc-Cxcl2在小鼠肺上皮细胞核中表达增加，以应对病毒感染
2、lnc-Cxcl2选择性抑制病毒感染期肺上皮细胞CXCL12的表达
对lnc-Cxcl2敲除和对照的细胞进行病毒感染，然后转录组测序，发现21个基因在敲除组异常表达（图2A），其中CXCL2上调表达（图2B）。和转录组测序一致，我们发现Cxcl2的表达和分泌型CXCL2的表达在lnc-Cxcl2敲除组显著升高（图2C-D）。并且lnc-Cxcl2缺陷增加了IAV和VSV感染的AECs和TECs细胞中的Cxcl2表达，但在AMs中没有（图2E）。因此， lnc-Cxcl2在病毒感染时选择性地抑制小鼠肺上皮细胞中Cxcl2的表达。
图2 lnc-Cxcl2选择性抑制病毒感染时肺上皮细胞中Cxcl2的表达
lnc-Cxcl2−/−小鼠在外观、体重和行为上与lnc-Cxcl2+/+同窝小鼠几乎没有区别。并且lnc-Cxcl2+/+和lnc-Cxcl2−/−小鼠脾脏免疫细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞的比例也相似，提示lnc-Cxcl2缺乏并不影响小鼠免疫细胞的发育。所以，用IAV鼻腔感染这些小鼠，以肺上皮细胞为靶点感染并诱导肺炎症和组织损伤。结果发现，与lnc-Cxcl2+/+小鼠相比，lnc-Cxcl2−/−小鼠在IAV感染后，体重下降更多，肺中Cxcl2的表达增加，但不包括其他促炎细胞因子，如Ccl2、Ifnb1或Tnf (图3A-B)。此外，lnc-Cxcl2−/−小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF)中CXCL2水平和中性粒细胞数均高于lnc-Cxcl2+/+小鼠（图3C-D）。与此一致的是，IAV感染后lnc-Cxcl2−/−小鼠与lnc-Cxcl2+/+小鼠相比，肺中性粒细胞浸润更严重，炎症更严重，组织损伤更严重（图3E-F）。表明lnc-Cxcl2−/−小鼠中由于CXCL2的表达增高所以更多的中性粒细胞被募集至肺部，加重病情。表明lnc-Cxcl2通过抑制CXCL2表达和中性粒细胞募集抑制流感病毒诱导的体内肺炎症。
图3 lnc-Cxcl2在体内抑制流感病毒诱导的肺炎症
4、lnc-Cxcl2以顺式作用结合并维持Cxcl2启动子的染色质抑制状态
为了探究lnc-Cxcl2如何抑制Cxcl2的，首先作者检测了lnc-Cxcl2对转录因子的调控，发现核定位转录因子P65, P50, STAT1, STAT3或c-JUN的表达都不受lnc-Cxcl2的调控，所以猜测lnc-Cxcl2是以顺式作用的方式调控Cxcl2。作者发现lnc-Cxcl2缺陷增加了Cxcl2 pre-mRNA水平以应对病毒感染(图4A)，Cxcl2启动子的染色质可访问性（以DNase敏感性表示）也增加了，以响应病毒感染(图4 B)。一致地，Cxcl2启动子中H3K4me3和CREB结合蛋白(CBP)的水平，是两种活性转录标记，在lnc-Cxcl2敲除细胞中增加（图4C-D）。Cxcl2启动子的总RNA聚合酶和磷酸化RNA聚合酶II水平也在lnc-Cxcl2敲除细胞中增加（图4E-F），提示lnc-Cxcl2抑制Cxcl2启动子的染色质可及性和Cxcl2的转录。
为了探究lnc-Cxcl2如何调控Cxcl2启动子染色质可及性，使用antisense和lnc-Cxcl2探针分离lnc-Cxcl2结合的染色质，发现探针可以成功捕获lnc-Cxcl2，特别是在VSV干扰后，并且Cxcl2的启动子两个κB区域显著富集lnc-Cxcl2探针。表明在病毒感染期间，lnc-Cxcl2顺式结合Cxcl2启动子并维持Cxcl2启动子染色质的抑制状态。
图4 lnc-Cxcl2以顺式结合并维持Cxcl2启动子受抑制的染色质状态
5、lnc-Cxcl2通过核糖核蛋白La抑制Cxcl2表达
接下来探究lnc-Cxcl2是否通过其相互作用的蛋白抑制染色质的可及性。使用RNA pull-down和MS鉴定与lnc-Cxcl2相互作用的核蛋白，得到核糖核蛋白La。为了验证lnc-Cxcl2通过与La相互作用抑制Cxcl2转录的假设，首先证实lnc-Cxcl2与La之间的相互作用（图5A-B）。构建La的截短突变体，发现只有包含第二个RRM的La片段与lnc-Cxcl2结合，表明La通过RRM2与lnc-Cxcl2相互作用（图5C）。为了研究La在调节Cxcl2表达中的作用，构建了La缺陷(Ssb−/−)的MLE-12细胞。发现La缺失不仅增加了Cxcl2的表达，而且还增加了其他趋化因子和促炎细胞因子的表达，如Ccl2、Ifnb1和Tnf，以应对病毒感染（图5D）。然后，研究了La如何抑制这些细胞因子的表达，发现La缺失增加了Cxcl2和Ccl2启动子的染色质可及性（图5E）。总之，虽然La抑制许多细胞因子的表达，但lnc-Cxcl2可以结合Cxcl2启动子，在病毒感染过程中通过核糖核蛋白La抑制Cxcl2顺式表达。
图5 lnc-Cxcl2通过核糖核蛋白La抑制Cxcl2表达
6、lnc-CXCL2-4-1抑制人肺上皮细胞免疫细胞因子表达
虽然lncRNA在不同物种之间被认为是低保守的，但在人类细胞中是否也存在类似的机制。通过搜索lncRNA数据库，在人类CXCL2的下游发现了4个与CXCL2相关的转录本，分别为lnc-CXCL2-1-1、lnc-CXCL2-2-1、lnc-CXCL2-3-1、lnc-CXCL2-4-1。其中，lnc-CXCL2-3-1预测有编码框，因此只有其他3个转录本被认为是ncRNA，然而，这三种lncRNA的具体功能尚未被阐明。因此，首先检测了这些lncRNA在A549人肺上皮细胞中的表达，发现IAV感染后lnc-CXCL2-1-1的表达显著增加，而lnc-CXCL2-1-1和lnc-CXCL2-2-1的表达仅轻微增加（图6A）。然后检测lnc-CXCL2- 4-1是否参与了趋化因子表达的调控。通过转录组分析发现，IAV感染后lnc-CXCL2-4-1沉默的A549细胞中有364个基因表达上调，32个基因表达下调（图6B）。对这些差异表达基因的GO分析表明，它们的分子功能丰富于细胞因子活性，包括趋化因子、干扰素和其他促炎细胞因子（图6C-D）。进一步证实沉默lnc-CXCL2-4-1确实增加了IAV感染后A549细胞中CXCL2和CXCL8的表达。此外，lnc-CXCL2-4-1与La相互作用，沉默La的表达增加了IAV感染后A549细胞中CXCL2和CXCL8的表达(图6 F和G)，表明lnc-CXCL2-4-1抑制细胞因子的表达。综上所述，这些结果表明，不同物种的宿主通过增加一种lncRNA的表达来抑制病毒诱导的肺炎症，该lncRNA可以反馈抑制肺上皮细胞中趋化因子的产生。
图6 lnc-CXCL2-4-1抑制人肺上皮细胞中细胞因子的表达
参考文献：
Liu Shuo., Liu Jiaqi., Yang Xue., Jiang Minghong., Wang Qingqing., Zhang Lianfeng., Ma Yuanwu., Shen Zhongyang., Tian Zhigang., Cao Xuetao.(2021). Cis-acting lnc-Cxcl2 restrains neutrophil-mediated lung inflammation by inhibiting epithelial cell CXCL2 expression in virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A, 118(41), undefined. doi:10.1073/pnas.2108276118