SNHG7促进肿瘤耐药和巨噬细胞M2极化
小核仁RNA宿主基因7 (small nucleolar RNA host gene 7，SNHG7) 的衍生lncRNA在包括肺腺癌（LUAD）在内的多种癌症中已被广泛报道。然而，lncRNA SNHG7是否参与LUAD的多西他赛耐药尚不清楚。本文发现外泌体介导SNHG7的转移增强了肺腺癌的多西他赛耐药。本文于2021年10月发表在《Cancer Letter》IF：8.679杂志上。
技术路线：
主要实验结果：
首先检测SNHG7是否和LUAD细胞抵抗多西他赛有关，结果显示与相应的亲代细胞相比，SNHG7在多西他赛耐药的LUAD细胞系（H1299/DTX and SPC-A1/DTX）中高表达（图1A）。敲除SNHG7后，H1299/DTX and SPC-A1/DTX对多西他赛的耐药性显著降低（图1B-C），表明SNHG7增强LUAD细胞对多西他赛的抗性。此外，SNHG7在耐药细胞和相应的亲代细胞中都主要分布于细胞质中，表明其增强耐药性是通过转录后调控。
图1 SNHG7增强LUAD细胞对多西他赛的抗性
2、SNHG7增强LUAD细胞的多西他赛抗性，诱导巨噬细胞M2极化
为了研究SNHG7是否影响多西他赛对LUAD细胞的生物学功能，在有无多西他赛处理下进行功能实验。如图2A-C所示，陈曼SNHG7降低了0或100μg/L多西他赛暴露后的H1299/DTX and SPC-A1/DTX细胞的增殖，但增加了细胞凋亡。在小鼠体内，多西他赛抑制肿瘤生长，减小肿瘤体积和重量，而这种作用在SNHG7敲除后进一步被放大（图2D-F）。因此，SNHG对多西他赛在LUAD细胞中的抗肿瘤作用有负面影响。
众所周知M2极化的肿瘤相关巨噬细胞会促进肿瘤进展和化学抗性。所以作者想知道SNHG7是否会影响巨噬细胞M2极化。结果显示IL-3处理巨噬细胞增加了M2标志物的表达，包括CD206和ARG1，但是敲除SNHG7会反转这种趋势（图2G-H）。此外，IL-3处理增加了CD11b+CD206+标记的巨噬细胞比例，但敲除SNHG7会反转这种作用（图2I）。这些结果表明SNHG7正向调节巨噬细胞M2极化。
图2 SNHG7增强LUAD细胞的多西他赛抗性，诱导巨噬细胞M2极化
3、SNHG7通过调节ATG5和ATG12诱导多西他赛耐药的LUAD细胞自噬
自噬在调控肿瘤细胞耐药中发挥着重要作用，所以作者猜测SNHG7可能通过自噬促进耐药，于是检测了敲除SNHG7后耐药细胞H1299/DTX和SPC-A1/DTX中自噬相关基因的表达。如图3A所示，WB表明敲除SNHG后暴露0或100μg/L多西他赛 H1299/DTX and SPC-A1/DTX细胞中LC3I/II, ATG5, ATG12的表达显著降低，但不影响ATG7和ULK1；100μg/L多西他赛处理显著降低了H1299/DTX and SPC-A1/DTX细胞中LC3-II/LC3-1, ATG5, ATG7, ATG12, and ULK1水平，但同时敲除SNHG7只增强了多西他赛导致的LC3I/II, ATG5, ATG12的表达降低作用。这表明SNHG7正调节自噬通过ATG5和ATG12。此外，免疫荧光显示敲除SNHG7可以减少自噬小体和ATG5和ATG12蛋白水平，但是没有改变其mRNA水平，并且荧光素酶实验显示SNHG7不能改变ATG5和ATG12的启动子荧光素酶活性（图3B-D），表明SNHG7不是在转录水平调控ATG5和ATG12。
图3 SNHG7通过调节ATG5和ATG12诱导多西他赛耐药LUAD细胞自噬
4、SNHG7招募HuR以稳定ATG5和ATG12从而影响LUAD细胞的增殖、凋亡和多西他赛耐药
接下来，研究SNHG7如何调控ATG5和ATG12。首先进行RNA pulldown实验获得与antisense比较在，senseSNHG7中差异的蛋白条带，然后用MS识别差异条带，获得与SNHG7相互作用的蛋白，结果发现CUL4A和HuR在senseSNHG7中显著富集（图4A-B）。RIP证实SNHG7可以被HuR抗体富集沉淀（图4B-C）。RIP证明HuR和ATG5和ATG12有结合作用（图4D-E），并且，敲除SNHG7减少了ATG5和ATG12和HuR的结合（图4F）。此外，敲除SNHG7或HuR的表达都会显著降低ATG5和ATG12的mRNA稳定性（图4G-H）。以上结果表明SNHG7招募HuR以稳定ATG5和ATG12。
之后作者通过拯救实验证明SNHG是通过 ATG5和ATG12影响LUAD细胞的增殖、凋亡和多西他赛耐药性的（结果未展示）。
图4 SNHG7招募HuR稳定ATG5和ATG12
5、多西他赛耐药LUAD细胞分泌的外泌体SNHG促进LUAD的耐药性和巨噬细胞M2极化
如图5A-D所示，分离获得了耐药性LUAD细胞系H1299/DTX and SPC-A1/DTX的外泌体，随后这些被PKH67标记的外泌体显示分布在H1299/DTX and SPC-A1/DTX的细胞质中。之后，将这些外泌体和SNHG7敲除或未敲除的巨噬细胞共孵育。结果发现外泌体处理组M2标志物显著上调，但是当同时敲除SNHG7后，这种上调作用被减弱（图5E-F）。类似的，CD11b+CD206+巨噬细胞比例在外泌体处理组显著上调，在SNHG7+外泌体组显著回落（图5G）。表明耐药性LUAD细胞来源外泌体SNHG7促进LUAD细胞的耐药性和巨噬细胞M2极化。
图5来自多西他赛耐药LUAD细胞的外泌体SNHG7促进LUAD细胞的多西他赛耐药和巨噬细胞M2极化
6、SNHG7通过招募CUL4A增加PTEN泛素化水平，激活PI3K/AKT通路介导巨噬细胞M2极化
随后探究SNHG7调控M2极化的机制。作者首先筛选了9条常见的信号通路，并进行荧光素酶实验，发现只有PI3K/AKT信号通路的荧光素酶信号在SNHG敲除后显著下降（图6A）。随后WB验证表明敲除SNHG7会显著抑制外泌体处理的巨噬细胞AKT的磷酸化，但对其mRNA的表达无影响（图6B-C）。亚细胞定位也显示外泌体处理的巨噬细胞中SNHG7主要定位与细胞质（图6D）。之后过表达SNHG7的同时用蛋白合成抑制剂CHX处理外泌体孵育后的巨噬细胞，发现过表达SNHG7后PTEN蛋白稳定性下降，并且外泌体处理的巨噬细胞中PTEN的泛素化增加了，而MG132阻断了这种SNHG过表达对PTEN泛素化的抑制作用（图6E）。
此外，之前的MS鉴定到的CUL4A是一个泛素化相关蛋白。所以作者推测SNHG7可能通过招募CUL4A调控PTEN的泛素化。FISH-IF共染证明了CUL4A和SNHG7之间的共定位（图6F），RIP和RNA pulldown证实了两者间的结合关系（图6G-H）。此外，co-IP实验结果表明PTEN可以被CUL4A富集沉淀，而这种富集在过表达SNHG7之后显著上调。以上表明SNHG7是通过招募CUL4A调控PTEN的泛素化。
图6 SNHG7通过招募CUL4A促进PTEN泛素化激活PI3K/AKT通路
综上所述，本研究表明外泌体SNHG7通过诱导LUAD细胞自噬和促进巨噬细胞M2极化促进LUAD细胞多西他赛耐药。机制上，SNHG7招募HuR稳定ATG5和ATG12，诱导LUAD细胞自噬。同时，耐多西他赛的LUAD细胞分泌外泌体SNHG7，促进亲代LUAD细胞耐多西他赛。此外，外泌体SNHG7通过招募CUL4A促进PTEN泛素化，激活PI3K/AKT通路，触发巨噬细胞M2极化。
图7 SNHG7诱导LUAD细胞多西他赛耐药和巨噬细胞M2极化的分子机制
参考文献：
Zhang Kai., Chen Jing., Li Chen., Yuan Yuan., Fang Surong., Liu Wenfei., Qian Yingying., Ma Jiyong., Chang Ligong., Chen Feifei., Yang Zhenhua., Gu Wei.(2021). Exosome-mediated transfer of SNHG7 enhances docetaxel resistance in lung adenocarcinoma. Cancer Lett, undefined (undefined), undefined. doi:10.1016/j.canlet.2021.10.029