新思路——铁死亡依赖的巨噬细胞外泌体通过运载铁蛋白促进间皮癌变
石棉诱导的相关疾病仍然是世界范围内的社会负担。作者之前的研究发现，石棉诱导的间皮细胞富含铁，并有不断的巨噬细胞铁死亡。然而，这种诱变环境如何影响间皮细胞的分子机制尚未阐明。这里，作者提出了一个新的机制：铁死亡的巨噬细胞产生的细胞外囊泡介导石棉相关的间皮细胞突变。随后作者通过一系列体内外实验证实了该猜想。本文于2021年10月发表在《Redox Biology》IF：11.799杂志上。
技术路线：
主要实验结果：
1、铁死亡依赖的细胞外囊泡（FedEVs）在石棉诱发的诱变环境中凝聚
首先进行组织学评估，使用小鼠腹膜注射青石棉注射模型来阐明FedEVs在石棉诱导的肉芽肿瘤中的组织定位。在石棉注射6个月后，观察到慢性肉芽肿性腹膜炎是由于异物与过量的铁的反应，类似于作者之前的报道(Fig. 1ad)。免疫荧光分析显示，石棉纤维存在于CD68阳性的巨噬细胞内，而不存在于α- SMA阳性的肌成纤维细胞和间皮阳性的间皮细胞中(Fig. 1a)。值得注意的是，EV的标记物CD63在肉芽肿附近的间皮细胞和肌成纤维细胞中呈颗粒状显著富集(Fig. 1bc)。作者之前报道，在石棉诱导的巨噬细胞死亡在富铁环境下铁死亡是主要形式。因此，作者推测是否是铁死亡导致巨噬细胞EV分泌增加。CD63的WB分析显示，加入GPX4抑制剂RSL-3（即铁死亡诱导剂）后，HT1080细胞分泌EV显著增加(Fig. 1ef)。类似地，石棉暴露的富铁环境下的THP1巨噬细胞，增加了EV的产生和分泌(Fig. 1gh)。此外，通过纳米跟踪分析(NTA)发现，在富铁条件下，青石棉石暴露时EV数量增加最多(图1kl)，其直径为150 nm，峰值在250 nm和350 nm处发生位移(图1ij)。这些结果表明石棉依赖的巨噬细胞铁死亡是和EV分泌直接相关的，石棉诱导的肉芽肿是FedEVs的一种输出基质。
图1 CD63阳性的FedEVs在石棉诱发的诱变环境中凝聚
2、间皮细胞内化FedEVs
接下来探究间皮细胞内化FedEVs的可能性。构建GFP-CD63稳定过表达的THP1和HT1080细胞系，作为FedEVs供体细胞（Fig. 2a）。将GFP标记的FedEVs加入MeT-5A间皮细胞后，在受体MeT-5A细胞的质膜上观察到来自供体细胞的GFP-CD63，从0.5 h开始，持续到3 h，形成泡状结构。在6 ~ 9小时后，FedEVs被受体间皮细胞完全内化，从GFP-CD63和内源性CD63共存的细胞质可以看出(Fig. 2bc)。然后，评估了在24小时内，间皮细胞中催化Fe(II)的含量，通过FACS分析显示，细胞内催化Fe(II)的含量显著增加(Fig. 2d-g)。这些结果表明，FedEVs可能将铁从铁死亡的巨噬细胞转运到间皮细胞。
图2间皮细胞内化FedEVs
3、FedEVs以铁蛋白为主要成分
为了全面鉴定FedEVs中的蛋白质成分，使用LC-MS进行了蛋白质组学分析。从暴露于铁和/或青石棉96小时的巨噬细胞分泌的FedEVs中提取蛋白质。将差异表达蛋白(未处理vs青石棉和铁处理)整合为蛋白质图谱图像，涵盖整个项目并列出前15个差异增加蛋白(Fig. 3ab)。铁蛋白轻链和重链(FTL和FTH)是铁在FedEVs中的储存铁的蛋白质。值得注意的是，只有铁或铁和青石棉处理组的FedEVs含有大量的FtL和FtH (Fig. 3cd)，这与铁过量有关。作者还证实了在体内，FtL和CD63在青石棉肉芽肿周围的间皮细胞上的共定位(Fig. 3e)。这些结果表明，FedEVs可以通过铁蛋白转运铁。
图3非选择性蛋白质组分析显示铁蛋白是石棉诱导的FedEVs的主要成分
为了进一步了解FedEVs的生物学意义，对FedEVs受体间皮细胞进行了RNA测序和转录分析。该分析在FedEVs暴露后的FedEVs-high或-low间皮细胞上进行了3个重复，该细胞通过铁死亡的巨噬细胞来源的GFP-CD63分化，以未处理的间皮细胞为对照(Fig. 4a)。FDR校正的p值小于0.01和log2FC绝对值大于0.5为参数，鉴定出245个差异表达基因，其中163个表达上调，82个表达下调(Fig. 4bc)。GO分析将FedEVs受体细胞的基因表达变化与有丝分裂期的细胞周期联系起来，而中体和着丝粒在细胞成分中占过多的比例(Fig. 4d)。上调基因的基因集富集分析(GSEA)也显示在FedEVs-high受体间皮细胞中有丝分裂相关基因集显著上调(Fig. 4e)。特别是，在FedEVs-high的受体间皮细胞中，Cyclin B1和Cyclin D1的表达增加(Fig. 4fg)。这些结果表明，FedEVs的摄取和有丝分裂过程在受体间皮细胞中是一致的。
图4间皮细胞中FedEVs摄取与有丝分裂的一致性
5、有丝分裂间皮细胞内化FedEVs导致铁超载
为了确定有丝分裂间皮细胞是否确实内化了FedEVs，建立了FedEVs供体BFP-CD63巨噬细胞(THP1)和表达Fucci的受体间皮细胞，其中G1(红色)、S(黄色)和G2/M(绿色)相位显示不同的荧光(fMeT- 5A)。结合FACS和免疫印迹分析可以同时检测具有BFP-CD63的FedEVs-high受体细胞(Fig. 5a)和间皮细胞的G1、S和G2/M期(Fig. 5be)。摄取FedEVs后，在S期和G2/M期fMeT-5A细胞中BFP-CD63增加(Fig. 5c-e)。此外，与未处理细胞相比，FedEVs受体间皮细胞中FtL和FtH蛋白水平升高，而TfR1和IRP2表达下降，表明处于铁充足状态（Fig. 4fg）。相反，铁相关蛋白的表达在FedEVs受体间皮细胞的G1期和G2/M期之间没有明显变化（Fig. 5fg）。此外，细胞周期相关蛋白，包括细胞周期蛋白Cyclin B1和Cyclin D1，和CDKs，在未处理对照组和FedEVs受体间皮细胞之间也没有表达变化（Fig. 5fg）。这些数据表明，FedEVs的摄入直接导致铁过剩，而没有明显改变细胞周期。
6、内吞FedEVs增强间皮细胞DNA损伤
为了评估FedEVs受体间皮细胞中的DNA损伤，进行了氧化DNA碱基修饰和DNA双链断裂的FACS和成像分析。8-OHdG是由羟基自由基、单氧或过氧亚硝酸盐引起的最丰富的DNA修饰之一。γH2AX被快速招募到DNA双链断裂处进行修复，从而作为DNA损伤标志物。间皮细胞被暴露在石棉诱导的TPH1来源的FedEVs中，24小时后进行γH2AX评估。结果观察到FedEVs的受体细胞核中8-OHdG和γH2AX水平均显著增加（Fig. 6a–e），该结果在腹膜注射的小鼠模型中得到证实，肉芽肿周围间皮细胞中γH2AX，CD63和FtL增加（Fig. 6fg）。
图6内吞FedEVs导致受体间皮细胞的氧化DNA碱基修饰和DNA双链断裂
参考文献：
Ito Fumiya., Kato Katsuhiro., Yanatori Izumi., Murohara Toyoaki., Toyokuni Shinya.(2021). Ferroptosis-dependent extracellular vesicles from macrophage contribute to asbestos-induced mesothelial carcinogenesis through loading ferritin. Redox Biol, 47(undefined), 102174. doi:10.1016/j.redox.2021.102174