KIAA1429-结直肠癌预后标志物
m6A是哺乳动物中最丰富的mRNA修饰，参与了mRNA的代谢。KIAA1429被认为是最大的m6A甲基转移酶，在m6A修饰中发挥重要作用。然而，KIAA1429在结直肠癌(CRC)中的预后价值和功能尚不清楚。我们研究发现KIAA1429在结直肠癌组织中显著上调。KIAA1429高表达患者的总生存期较低表达患者短。KIAA1429在体外和体内均能促进结直肠癌细胞的增殖。KIAA1429通过与WEE1 mRNA 3′-UTR第三段结合，以m6A独立的方式降低WEE1的稳定性，从而对WEE1的表达产生负调控作用。此外，丁酸通过下调转录因子NFκB1的水平降低了KIAA1429的表达。这些结果提示KIAA1429可能是CRC潜在的预后指标。本文于2021年11月发表在“Oncogene”（IF: 9.867）期刊上。
技术路线
结果
1）KIAA1429在人CRC中表达上调
我们对TCGA数据库和GEO数据集进行分析，发现与相邻正常组织相比，结直肠癌组织中KIAA1429的mRNA表达升高(图1A)。此外，KIAA1429的高表达与临床分期进展相关(图1B)。通过TCGA数据库分析，ROC曲线下面积(AUC)为0.70(图1C)。ROC分析结果提示KIAA1429可能是CRC的诊断标志物。Kaplan Meier生存分析表明，KIAA1429表达高的CRC患者的OS比KIAA1429表达低的CRC患者的OS短(图1D)。为了证实TCGA数据库和GEO数据集中分析的结果，我们通过qRT PCR检测了43对结直肠癌组织和邻近正常组织中KIAA1429的表达，并通过IHC检测了5对结直肠癌组织和邻近正常组织中KIAA1429的表达。结果表明，在mRNA和蛋白质水平上，与相邻正常组织相比，结直肠癌组织中KIAA1429的表达显著增加（图1E、G）。通过43对CRC组织和相邻正常组织分析，AUC为0.66(图1F)，这验证了KIAA1429可能是CRC的诊断生物标志物。Kaplan–Meier生存分析表明KIAA1429高表达的结肠癌患者OS和无进展生存率（PFS）较差（图1H，I）。总之，这些发现表明KIAA1429在结肠癌组织中升高，可能是结肠癌患者的预后生物标志物。
CCK-8和集落形成分析表明KIAA1429的下调抑制了结直肠癌细胞的增殖和集落形成能力（图2A，C），而KIAA1429的过表达促进了结直肠癌细胞的增殖和集落形成能力（图2B，D）。细胞周期分析表明，KIAA1429的敲除增加了G2期细胞的百分比（图2E），KIAA1429的过表达降低了G2期细胞的百分比（图2F）。此外，沉默KIAA1429表达显著抑制体内CRC肿瘤生长和肿瘤重量（图2G-I）。综上所述，这些结果表明KIAA1429可能作为癌基因在体外和体内促进结直肠癌增殖。
3）KIAA1429负调控WEE1表达
为了进一步探索KIAA1429促进结直肠癌细胞增殖的分子机制，我们在KIAA1429敲除细胞和相应的对照细胞中进行RNA-seq检测（图3A）。在我们之前的研究中，进行了RNA免疫沉淀和mRNA高通量测序（RIP-seq），以确定与KIAA1429蛋白相关的mRNA。在本研究中，我们通过结合RNA-seq和RIP-seq鉴定的差异表达基因进行Venn分析，结果显示63个基因重叠（图3B）。KEGG途径分析表明，细胞周期途径是最丰富的途径，主要包括WEE1、染色体1A的结构维持、转录因子Dp-1和小染色体维持复合物成分3。通过qRT PCR分析验证这些基因，结果显示WEE1在四个基因中变化最显著（图3C-F）。因此，WEE1被选为KIAA1429的候选下游目标，以供进一步研究。WEE1蛋白水平在KIAA1429敲除细胞中升高，在KIAA1429过表达细胞中降低（图3G，H）。根据IHC分析（图3I），在KIAA1429基因敲除的异种移植组织中，WEE1表达上调。此外，结肠癌组织中WEE1的mRNA水平降低（图3J），并且与结肠癌组织中KIAA1429的mRNA水平呈负相关（图3K）。这些结果表明KIAA1429对WEE1的表达具有负调控作用。
4）KIAA1429通过WEE1介导的肿瘤增殖调控促进了结直肠癌的发生
qRT-PCR和western blot检测证实沉默KIAA1429调控的增加的WEE1在WEEI敲除的DLD-1和LoVo细胞中表达明显降低（图4A，B）。WEE1的沉默逆转了DLD-1和LoVo细胞中KIAA1429基因敲除抑制的细胞增殖和集落形成能力（图4C-E）。细胞周期分析表明，敲除KIAA1429可增加G2期细胞的百分比，通过沉默WEE1可降低G2期细胞的百分比（图4F）。与这些观察结果一致，KIAA1429的敲除抑制了体内CRC肿瘤的生长，WEE1下调逆转了这种效应（图4G-I）。总之，这些发现表明KIAA1429通过调节结肠癌中WEE1的表达在促进肿瘤增殖中起着关键作用。
5）KIAA1429以非m6A依赖的方式调节WEE1的mRNA表达
RIP分析证实，在KIAA1429组中WEE1 mRNA显著富集，但在IgG组中未富集（图5A）。此外，在用Act D处理的DLD-1和LoVo细胞中敲除KIAA1429后，WEE1转录本的半衰期增加（图5B）。这些结果表明KIAA1429与WEE1 mRNA结合，并以转录后方式降低WEE1 mRNA的稳定性。接着，我们检测其是否以m6A依赖的方式调控WEE1的mRNA表达。结果表明，敲除KIAA1429不会改变m6A修饰的WEE1 mRNA水平（图5C）。然而，METTL3基因敲除降低了WEE1 mRNA的m6A修饰水平（图5D）。此外，METTL3敲除后，与KIAA1429相互作用的WEE1 mRNA的数量没有明显差异（图5E）。这些结果表明KIAA1429不影响WEE1 mRNA的m6A水平，并且KIAA1429和WEE1之间的相互作用不受m6A修饰的影响。接下来，我们探讨KIAA1429是否以m6A非依赖性方式降低WEE1 mRNA的稳定性。RIP序列结果显示KIAA1429与WEE1 mRNA的结合位点位于3′-UTR。为了进一步确定KIAA1429和WEE1 mRNA之间的结合位点，我们将WEE1 mRNA的预测3′-UTR分为三个片段。WEE1 mRNA中3′-UTR的第三段被抗KIAA1429抗体显著富集，但其他两段未被该抗体富集（图5F）。因此，我们对WEE1 mRNA的3′-UTR的第三段进行突变，以供进一步研究（图5G）。KIAA1429沉默后荧光素酶活性增加，经WEE1-3’-UTR MT3挽救（图5H）。综上所述，这些结果表明KIAA1429通过以m6A非依赖性方式降低WEE1 mRNA的稳定性来下调WEE1的表达。
6）丁酸通过转录因子NFκB1抑制KIAA1429的表达
我们之前的研究报告，丁酸盐是肠道菌群的代谢物，通过下调METTL3的表达抑制结直肠癌细胞增殖。因此，我们探讨了KIAA1429的表达是否也受丁酸的调控。如图6A所示，丁酸处理后KIAA1429的表达显著降低。通过生物信息学分析，我们发现转录因子NFκB1可能与KIAA1429基因的启动子区域结合。因此，我们推测丁酸可能通过降低NFκB1的表达来下调KIAA1429的表达。丁酸处理后，NFκB1和p-IKBα的mRNA和蛋白质表达水平显著降低（图6B，C）。此外，沉默NFκB1降低了KIAA1429的mRNA和蛋白质水平（图6D-F）。在敲低NFκB1后，荧光素酶活性降低，这通过KIAA1429启动子区域的突变得以挽救（图6G）。
结论：我们首次报道KIAA1429是CRC中一个潜在的预后标志物，它通过m6A独立方式下调WEE1表达促进增殖。此外，KIAA1429在CRC组织中表达明显升高，与CRC患者生存率低相关。丁酸通过抑制转录因子NFκB1降低KIAA1429的表达。这些发现可能为前瞻性的多机构试验铺平道路，以测试KIAA1429作为CRC患者的潜在预后标志物和治疗靶点的临床应用。
参考文献：Ma L, Lin Y, Sun SW, Xu J, Yu T, Chen WL, Zhang LH, Guo YC, Wang YW, Chen T, Wei JF, Zhu LJ. KIAA1429 is a potential prognostic marker in colorectal cancer by promoting the proliferation via downregulating WEE1 expression in an m6A-independent manner. Oncogene. 2021 Nov 24. doi: 10.1038/s41388-021-02066-z. Epub ahead of print. PMID: 34819634.