环状RNA ACTN4促进肝内胆管癌的进展

肝内胆管癌(ICC)是一种原发性肝癌，侵袭性高，预后极差。circRNAs在ICC癌变发生和进展中的作用仍有待确定。我们研究发现来自ACTN4基因外显子1-外显子20的Hsa_circ_0050898(命名circACTN4)在ICC中显著上调。circACTN4的高表达与体外和体内肿瘤增殖和转移增强以及ICC切除术后较差的预后相关。此外，circACTN4通过海绵蛋白miR-424-5p上调YAP1的表达。更重要的是，circACTN4还招募YBX1刺激FZD7转录。circACTN4在ICC细胞中的过表达增强了YAP1和β-catenin之间的相互作用。这些结果表明circACTN4是ICC潜在的预后标志物和治疗靶点。本文于2021年9月发表在“Journal of Hepatology”（IF: 25.083）期刊上。

技术路线

结果

1）CircACTN4在ICC组织中上调

芯片分析显示与邻近的非肿瘤组织比较，以log2 fold change >4.0 和p <0.05 为前提，17个circRNA在ICC组织中显著上调(图1A,B)。在 4个高表达的circRNA中，circACTN4的上调最显著。通过60对样品的qRT-PCR，证实了circACTN4在ICC组织中过表达，并对RNase R处理产生了抵抗(图1C,D)。通过qRT-PCR检测细胞中circACTN4的表达，在RBE和FRH0201细胞中分别发现了circACTN4的低表达和高表达(图1E)。使用荧光原位杂交和亚细胞分离试验，在RBE和FRH0201细胞的细胞核和细胞质中观察到circACTN4转录本(图1F,G)。与低circACTN4表达相比，在ICC中高circACTN4表达与较差的3年总生存率和更高的复发率相关 (图1H, I)。

2）CircACTN4促进体外和体内ICC细胞的增殖和侵袭

在集落形成实验中，过表达circACTN4促进RBE细胞的增殖，而敲除circACTN4抑制FRH0201细胞的增殖(图2A)。在transwell实验中，RBE细胞的迁移和侵袭增强，而FRH0201细胞的迁移和侵袭被抑制(图2B)。在内皮管形成实验中，RBE细胞上清液的促血管刺激因子增加了管长，而FRH0201细胞上清则相反(图2C)。在异种移植模型中，circACTN4沉默组肺转移数量和肿瘤生长较低，而circACTN4过表达组较高(图2D-G)。

3）CircACTN4调控FZD7在ICC细胞中的表达

RNA-seq在过表达circACTN4的RBE细胞中鉴定出103个差异表达基因 (图3A, B)。KEGG通路分析显示，Hippo相关基因(MOB1B、ID2、APC、PPP1CB、CCN2、PRKCI、BMPR2、YAP1和YWHAG)和wnt相关基因(ROCK2、EP300、APC、FZD7和AXIN2)均富集并过表达circACTN4。qRT-PCR进一步证实了这些基因在过表达circACTN4的RBE细胞中过表达(图3C, D)。Western blot结果显示，FZD7、ID2、CCN2和AXIN2的蛋白水平也随着circACTN4的过表达或敲除而改变(图3E)。

FZD7，Wnt/β-catenin通路的受体，在Hippo和Wnt通路中与ICC细胞中circACTN4过表达相关均升高。RNA-seq结果显示，在circACTN4沉默的FRH0201细胞中，FZD7的表达显著下调。在RNA-seq的559个DEGs中，Hippo信号通路也显著富集(图S5C-F)。利用TCGA数据库进一步分析发现，FZD7在ICC组织中的表达水平显著高于非肿瘤组织(图3F)。这些结果通过组织样本的qRT-PCR和IHC进一步证实(图3G, H)。此外，在20个ICC组织中，circACTN4的表达与FZD7的表达呈正相关(图3I)。为了确定circACTN4是否调控FZD7的转录，我们在FRH0201细胞中进行了ChIRP (RNA提取染色质)实验，结果显示circACTN4在FZD7启动子转录起始位点(TSS)的−1200到−800 bp区域富集(图3J)。同时，在FRH0201细胞中，circACTN4沉默后，H3K27Ac组蛋白活性修饰在同一位点的富集减少，而在RBE细胞中，过表达circACTN4后，H3K27Ac组蛋白活性修饰增加(图3K, L)。这些结果表明，circACTN4可以结合FZD7启动子并触发FZD7的表达。

4）CircACTN4与YBX1相互作用

RNA下拉和western blotting显示，生物素标记的circACTN4探针可以在FRH0201细胞裂解液中沉淀内源性的YBX1(图4A)， RIP和RNA EMSA进一步证实了这一点(图4B, C)。这些结果表明circACTN4和YBX1之间存在相互作用。circACTN4的表达与YBX1呈正相关(图4D)。此外，TCGA数据显示，YBX1在ICC组织中的表达明显高于非肿瘤组织(图4E)，这一点通过qRT-PCR和IHC在ICC组织样本、RBE和FRH0201细胞系中得到了验证(图4F, G)。circACTN4在RBE细胞中过表达，在FRH0201细胞中敲除，均不影响YBX1 mRNA的表达(图4G)。这些结果表明，circACTN4与YBX1相互作用，并在ICC进展过程中启动下游基因转录。

5）CircACTN4招募YBX1共同激活FZD7的转录

ChIP-seq分析显示，FRH0201细胞中YBX1结合区域广泛分布于基因组中，其中24.88%为启动子(图5A, B)。对YBX1结合区域的Motif分析显示其结合序列偏好存在差异(图5C)。通过重叠RNA-seq和ChIP-seq的结果，我们发现FZD7是ICC细胞中circACTN4和YBX1的靶点(图5D)。ChIP-qPCR结果显示，YBX1在ICC细胞中参与FZD7表达的调控，因为YBX1与FZD7启动子在同一位点富集(图5E)，这与circACTN4的结果一致(图3J)。此外，在FRH0201细胞中，YBX1敲低抑制了H3K27Ac修饰在FZD7启动子上的富集(图5F)。为了进一步证实circACTN4和YBX1共同调控FZD7的转录，我们在FRH0201细胞中敲除circACTN4，发现YBX1在FZD7启动子上的富集减少(图5G)。FZD7 mRNA和蛋白水平在FRH0201细胞中的变化也与YBX1过表达和敲低一致(图5H)。细胞功能实验表明，YBX1恢复挽救了FZD7下调介导的FRH0201细胞生长、血管形成和转移的抑制(图5I-L)。这些结果提示circACTN4可能在YBX1介导的FZD7在ICC细胞中的表达中起重要作用。

6）CircACTN4通过海绵吸收miR424-5p上调YAP1的表达

circRNA Interactome数据库预测circACTN4可作为多个miRNA的海绵。通过结合来自Starbase和Circbase的miRNA靶点预测结果，12个候选miRNA被预测为circACTN4和YAP1的靶点(图6A)。使用TCGA，发现12个候选基因中有6个在ICC组织中表达。此外，在转染si-circACTN4的FRH0201细胞中，只有miR-424-5p上调(图6B)，而在RNA RIP检测中，circACTN4可直接与miR-424-5p结合(图6C)。转染miR-424-5p的模拟物可降低RBE细胞的增殖、迁移和侵袭能力(图6 D,E)。此外，在转染miR-424-5p mimic的RBE细胞中，YAP1 mRNA和蛋白水平显著降低，这与转染miR-424-5p inhibitor的RBE细胞中的YAP1 mRNA和蛋白水平形成鲜明对比(图6F)。这些结果表明，circACTN4通过海绵吸收miR-424-5p调节YAP1的表达。此外，荧光素酶报告基因检测显示，与对照组相比，在与miR-424-5p模拟物和野生型荧光素酶报告基因共转染的HEK-293 T细胞中，荧光素酶活性显著降低(图6G)。RIP实验也显示，与IgG组相比，argonaute 2组circACTN4和miR-424-5p的富集量增加(图6H)。这些发现表明circACTN4在ICC细胞中充当了miR-4245p上调YAP1的海绵。

7）CircACTN4参与Wnt/Hippo信号通路

由于FZD7是Wnt信号通路受体，我们推测circACTN4可能通过促进FZD7转录参与了该通路的调控。β-catenin和p-GSK3b表达的变化与circACTN4过表达或敲低一致(图7A)。在circACTN4过表达的RBE细胞中，β-catenin的核定位显著增加，而在circACTN4下调的FRH0201细胞中，β-catenin的核定位显著降低(图7B)。TOP/FOP-Flash报告分析也显示，Wnt/β-catenin通路活性分别随circACTN4过表达或敲除而显著增加或降低(图7C)。我们进一步通过免疫荧光检测了circACTN4对β-catenin和YAP1蛋白细胞定位的影响(图7D)。结果显示，YAP1和β-catenin在过表达circACTN4的RBE细胞中共定位，而circACTN4促进了它们的核积累。共免疫沉淀进一步证实了YAP1与β-catenin的相互作用增强(图7E)。这些结果表明，circACTN4增强了YAP1与β-catenin、Hippo和Wnt通路的相互作用，促进了它们在ICC中的激活。

结论：CircACTN4在ICC中上调，通过作为miR-424-5p的分子海绵，以及与YBX1相互作用转录激活FZD7，促进ICC增殖和转移。这些结果表明circACTN4是ICC潜在的预后标志物和治疗靶点。

参考文献：Chen Q, Wang H, Li Z, Li F, Liang L, Zou Y, Shen H, Li J, Xia Y, Cheng Z, Yang T, Wang K, Shen F. Circular RNA ACTN4 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression by recruiting YBX1 to initiate FZD7 transcription. J Hepatol. 2021 Sep 9:S0168-8278(21)02025-0. doi: 10.1016/j.jhep.2021.08.027. Epub ahead of print. PMID: 34509526.