在结直肠癌中， CircHERC4作为一种新的致癌驱动因子，通过miR - 5565p /CTBP2/E- cadherin轴促进肿瘤转移

结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）患者死亡的主要原因是转移。越来越多的证据表明，CircRNA在癌症的起始和发展中发挥着关键作用。然而，CircRNAs协同癌症转移的潜在分子机制仍不明确。本研究探讨CircHERC4在CRC中的作用机制。本文于2021年10月发表在《Journal of Hematology ＆ Oncology》，IF= 11.059。

本文技术路线：

主要结果

1. CircHERC4在CRC中的识别与特征

首先，选择两对CRC组织和癌旁组织进行RNAseq，分析CircRNAs的表达谱，发现CRC组织中20个差异表达的CircRNA (FC≥10，P < 0.05)。为了筛选与转移相关的CircRNA，作者将这些被筛选的CircRNA中进行siRNA转染到CRC细胞中，并采用Transwell侵袭试验筛选出具有功能的环状RNA。结果发现CircHERC4 (has_Circ_0007113) 是CRC中过表达的最显著的驱动转移的CircRNA (Fig 1A)。CircBase报道CircHERC4来自HERC4基因，由4-8外显子(682 bp)头尾剪接组成。于是作者设计了一个分歧引物来扩增HERC4剪接形式，并通过Sanger测序证实CircHERC4中存在剪接连接(Fig 1B)。在DLD-1细胞中，Circ HERC4只能在cDNA中扩增，而不能在gDNA中扩增，这排除了由基因组重排引起的可能(Fig 1C)。此外，通过RNase R处理和放线菌素D实验检测CircHERC4的稳定性。RNase R和放线菌素D处理后，HERC4 mRNA的水平显著下调，而CircHERC4 mRNA水平保持不变(Fig 1C，D)。此外，通过核质分离后的qRT-PCR，发现CircHERC4主要位于细胞质中(Fig 1E)。

Fig1 CircHERC4在CRC细胞中的鉴定与表征

2. CircHERC4 mRNA的过表达与CRC患者预后不良相关

为了进一步明确CircHERC4在CRC中的致癌表型，采用qRT-PCR检测了120对组织样本中CircHERC4的表达情况。结果表明，CircHER4表达水平在CRC患者中明显升高(Fig 2A)。此外，CircHERC4高表达与淋巴转移(Fig 2B)和远处转移(主要是肝转移)呈正相关(Fig 2C)。进一步探索CircHERC4的过表达是否由宿主HERC4 mRNA的上调引起CRC。然而，在120个CRC组织中没有发现HERC4 mRNA显著增加(Fig 2D)。同样的，HERC4 mRNA与淋巴转移和肝转移也无相关性((Fig 2E,F)。因此，作者推测CircHERC4的过表达在CRC中是转录后被调控的。此外，Kaplan-Meier生存分析显示，CircHERC4高表达的患者总生存期较差(Fig 2G)。HERC4 mRNA表达水平与患者预后无相关性(Fig 2H)。综上所述，这些结果表明，CircHERC4(而非其宿主HERC4 mRNA)在CRC组织中显著上调，而更高的CircHERC4表达可能意味着预后不良。

Fig 2 CircHERC4在CRC组织中过表达并与转移相关

3. CircHERC4作为一种致癌基因，在体外和体内促进CRC的增殖、迁移和侵袭

为了确定CircHERC4的功能作用，作者检测了CircHERC4在人正常结肠上皮细胞（HCoEpic）和CRC细胞 (HCT116，DLD-1，HT29，LoVo和SW480) 中的表达。作者发现与正常结肠上皮细胞HCoEpic细胞相比，CircHERC4在CRC细胞中表达明显上调，CircHERC4在DLD-1和HCT116细胞中表达相对较高，而在SW480细胞中表达相对较低(Fig 3A)。因此，作者选择HCT116、DLD-1和SW480细胞进行进一步研究。接下来针对CircHERC4后剪接序列设计了siRNAs(Fig 3B)。用CircHERC4 siRNA转染DLD-1和HCT116细胞，成功地沉默了CircHERC4 (Fig 3C)。CCK-8实验显示，沉默CircHERC4可显著抑制DLD-1和HCT116细胞的活力(Fig 3D)。此外，集落形成实验显示，与阴性对照相比，CircHERC4下调组的DLD-1和HCT116细胞的增殖能力也受到抑制(Fig 3E)。此外，transwell实验显示，沉默CircHERC4可以抑制DLD-1和HCT116细胞的迁移和侵袭能力(Fig 3F)。而成功构建过表达CircHERC4质粒并转染到SW480细胞中，发现CircHERC4明显增加(Fig 3G)，提示CircHERC4上调可显著促进体外CRC细胞的增殖、迁移和侵袭能力(Fig 3H–J)。

此外，异种移植和转移小鼠模型也支持CircHERC4在体内发挥致癌作用的观点。在皮下肿瘤模型中，CircHERC4沉默(sh-CircHERC4-1和shCircHERC4-2)和阴性对照(sh-NC) HCT116细胞通过皮下注射到BALB/c裸鼠中。每7天测量肿瘤体积，并让肿瘤生长35天。结果显示，与阴性对照组相比，sh-CircHERC4组的肿瘤生长速度和肿瘤重量明显受到抑制(Fig 3K–M)。将上述三组HCT116细胞转移到肿瘤小鼠模型中，小鼠生长60天后，处死小鼠，取肺、肝进行HE染色，检测转移灶的形成。发现肺和肝脏均有转移性结节(Fig 3N)。与阴性对照组相比，sh-CircHERC4组肺、肝转移的发生率显著降低(Fig 3N)。HE染色进一步显示sh-NC组转移结节面积极高，而sh-CircHERC4组转移结节面积显著降低(Fig 3O)。以上数据证实了CircHERC4在体外和体内均能促进CRC的进展，特别是转移。

Fig3 CircHERC4作为一种致癌基因，在体外和体内调控增殖、迁移和侵袭

4. CircHERC4直接与CRC细胞中的miR - 5565p结合

CircHERC4主要位于CRC细胞的细胞质中，提示其可能具有转录后功能。因此，作者通过StarBase和Circinteractome预测其潜在的结合miRNA。作者初步筛选出了36miRNAs。为了确定这些miRNA是否能与CircHERC4结合，通过miRNA模拟物进行了荧光素酶筛选。作者构建了一个CircHERC4片段，并将其插入psiCHECK-2质粒中荧光素酶报告基因的下游。然后将miRNA模拟物与luc-CircHERC4报告质粒共转染293T细胞。与对照相比，其中7个miRNAs可以使荧光素酶活性降低至少40%，在双荧光素酶报告实验中，miR-556-5p对荧光素酶活性的抑制作用最强 (Fig 4A)。为了证实这一预测，作者设计了靶向连接位点的生物素化CircHERC4探针和scrambled oligo probes探针并用于在DLD-1细胞中进行RNA下拉试验。RNA下拉实验后的qPCR结果显示，CircHERC4 mRNA显著富集，而宿主HERC4 mRNA则不显著富集。通过qPCR检测CircHERC4拉下部分中所有具有荧光素酶活性抑制作用的7个miRNAs。miR-556-5p在CircHERC4下拉部分的富集显著高于NC组和其他miRNAs (Fig 4B)。这些结果提示miR-556-5p能直接与CircHERC4结合，并参与CircHERC4在CRC中的功能。

Fig 4 CircHERC4通过与miR-556-5p相互作用促进CRC细胞增殖、迁移和侵袭

5. miR -5556- 5p的抑制介导了CircHERC4的致癌功能，并激活了CRC中的Notch信号通路

由于目前尚无关于miR-556-5p在CRC的研究，作者首先通过qPCR检测证实了miR-556-5p在临床CRC样本中的表达模式。结果显示，与癌旁组织相比，miR-556-5p在CRC组织中下调(Fig 4C)。作者进一步分析了miR-556-5p在有无转移的CRC患者中的表达情况，结果显示miR-556-5p在有淋巴转移(Fig 4D)或远处转移患者中表达水平明显降低(Fig 4D,E)。为了探究miR-556-5p的功能作用，作者将miR-556-5p模拟物转染到DLD-1和HCT116细胞中。所有结果显示，miR-556-5p可显著抑制CRC细胞的增殖、迁移和侵袭能力(Fig 4F-H)。此外，通过挽救实验在SW480中共转染miR- 556-5p模拟物和CircHERC4过表达载体。结果发现，miR-556-5p模拟物可以部分恢复CircHERC4过表达增强SW480细胞的增殖、迁移和侵袭能力(Fig 4I-K)。综上所述， miR-556-5p具有抗癌作用，并通过直接结合在CRC中部分介导CircHERC4的致癌功能。

然而，可能受到CircHERC4/miR-556-5p轴的影响的下游信号通路尚不清楚。因此，作者在沉默CircHERC4或过表达miR-556-5p后进行了RNA测序。根据维恩图显示，作者筛选出了9109个在CircHERC4沉默和miR-556-5p过表达的DLD-1细胞中显著改变的转录本，KEGG通路富集分析表明，这9109个转录本富集在许多肿瘤相关信号通路中，尤其是被广泛认为是大肠癌发生激活因子的Notch信号通路(Fig 5B)。作者假设CircHERC4可能通过激活Notch信号通路促进细胞转移，而Notch信号通路可能被miR-556-5p阻断。

Fig 5 CTBP2是miR-556-5p的靶基因

6. CTBP2是miR - 5565p的靶点，通过抑制结直肠癌中E - cadherin的表达发挥致癌作用

作者进一步探讨了miR-556-5p靶向的Notch信号通路的效应因子。热图显示，Notch信号通路中的大部分基因通过沉默CircHERC4和过表达miR-556-5p而下调(Fig 5C)。结合生物信息学分析，CTBP2被预测为miR-556-5p的靶点(Fig 5D)。为了进一步证实这一假设，作者进行了荧光素酶实验来验证miR-556-5p和CTBP2之间的相互作用。将含有miR-556-5p野生型和突变型结合位点的CTBP2 3’UTR片段克隆到荧光素酶报告质粒psiCHECK2中，并与miR-556-5p 模拟物或miR-NC模拟物共转染到DLD-1细胞中。结果表明过表达miR-556-5p显著降低了包含野生型结合位点载体的荧光素酶活性，而非包含突变型结合位点载体的荧光素酶活性(Fig 5D)。此外，作者通过WB实验证明，miR-556-5p可以显著抑制CTBP2的蛋白水平，但却挽救了CTBP2[26]的靶基因E-cadherin的表达（Fig 5E）。

CTBP2被认为是结直肠癌中肿瘤发展的一个重要方面。作者分析了GEPIA数据库，发现CTBP2蛋白在结直肠癌组织中中位表达水平高于癌旁正常组织(Fig 6A)。 接下来，研究了120例CRC样本中CTBP2 mRNA的表达，在免疫组化中观察到了CTBP2在CRC中高表达(Fig 6B)。此外，生存分析评估也发现了CTBP2高表达与CRC患者较差的生存概率显著相关(Fig 6C)。作者构建并转染CTBP2 siRNA到DLD-1和HCT116细胞中，通过WB实验证实E-cadherin蛋白表达水平下降(Fig 6D)。与对照组相比，沉默CTBP2显著抑制DLD-1和HCT116细胞增殖、迁移和侵袭能力的表达(Fig 6E-G)。这些结果证明了CTBP2是miR-556-5p的靶基因，其过表达通过抑制E-cadherin介导CRC肿瘤转移。

Fig 6 CTBP2在CRC组织中过表达，可促进CRC细胞的发展

7. 沉默CTBP2可以消除过表达CircHERC4引起的作用

作者已经证实CircHERC4可以阻断miR-556-5p，于是进一步验证CircHERC4是否能调控miR-556-5p靶蛋白CTBP2的表达。转染lv - CircHERC4– shRNA到DLD-1和HCT116细胞中。结果发现，CircHERC4基因敲除后，CTBP2蛋白水平显著降低。相反，CTBP2的下游靶点E-cadherin显著增加(Fig 6H)。免疫组化染色检测sh-NC、sh-CircHERC4-1和sh-CircHERC4-2组HCT116细胞中CTBP2、E-cadherin和Ki67的表达。发现CircHERC4沉默后E-cadherin的表达水平被诱导，Ki-67在急剧下调(Fig 6i)。为了进一步研究CircHERC4是否通过诱导CTBP2的表达来产生致瘤性，作者进行了一项挽救实验来研究CircHERC4和CTBP2之间的功能相互作用。结果发现，与感染空载或siNC模拟物的SW480相比，转染CTBP2 siRNA模拟物的过表达CircHERC4的细胞增殖、迁移和侵袭能力明显下降(Fig 6J-I)，提示CircHERC4的致癌功能可以通过消除CTBP2的表达而部分逆转。WB结果显示，CTBP2可以部分挽救CircHERC4对E-cadherin表达的影响(Fig 6m)。

此外，根据CRC样本的临床分期，对10个高级别和10个低级别CRC样本进行FISH检查，以证实CircHERC4/miR-556-5p/CTBP2轴之间的关系。结果发现CircHERC4和CTBP2在高级别CRC组织中过表达，而miR-556-5p在低级别组织中含量较高(Fig 7A）。最后，进行了包含四组体内挽救实验(vector，CircHERC4 OE， CircHERC4 OE + CTBP2 siRNA， CircHERC4 OE + miR-556-5p mimic)。异种皮下移植结果表明，CircHERC4过表达可加速肿瘤生长，注射CTBP2 siRNA或miR-556-5p mimic后，这种作用可被抑制(Fig 7B-D)。

此外，免疫组化实验表明， 过表达CircHERC4可上调CTBP2和Ki67，下调E-ca的表达;这种效果可以通过抑制CTBP2或miR-556-5p过表达挽救(Fig 7E)。在尾静脉注射小鼠模型中，上调的CircHERC4促进了肺和肝转移结节的形成，当CTBP2下调或miR-556-5p上调时，CircHERC4诱导的致癌作用被阻断(Fig 7F-G)。总的来说，这些结果证明CTBP2可以促进CRC的进展，并且在体内和体外都受到CircHERC4/miR-556-5p轴的调控。

Fig7 CTBP2受circHERC4/miR-556-5p相互作用的调控

 
   综上所述，本研究发现了一个之前未被发现的致癌驱动因子CircHERC4。CircHERC4在CRC组织中升高，并与CRC的增殖、迁移和侵袭相关。此外，CircHERC4在CRC患者中的高表达与转移和较差的生存率呈正相关。作者提出了CircHERC4可以阻断miR-556-5p对CTBP2的抑制活性的机制;因此，沉默CircHERC4可以下调表达CTBP2同时活化E-cadherin(Fig 8)。

Fig 8阐明circHERC4通过miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin信号通路促进CRC发病和转移的机制

参考文献：

He, J., et al., Circular RNA circHERC4 as a novel oncogenic driver to promote tumor metastasis via the miR-556-5p/CTBP2/E-cadherin axis in colorectal cancer. J Hematol Oncol, 2021. 14(1): p. 194.