M2巨噬细胞外泌体装载小檗碱治疗脊髓损伤
脊髓损伤（SCI）导致巨噬细胞/小胶质细胞的免疫激活。激活的巨噬细胞/小胶质细胞具有两种表型：M1促炎经典活化表型和M2抗炎选择性活化表型。SCI的治疗由于缺乏能穿越血脑屏障（BBB）且具有靶向性和有效抗炎药物，因而面临巨大挑战。本文发现M2巨噬细胞来源的外泌体装载小檗碱可用于治疗SCI通过抑制M1炎症激活和抗凋亡。本文于2021年5月发表在《Acta Biomaterialia》IF：8.947期刊上。
技术路线：
实验设计：
主要实验结果：
1、外泌体鉴定
Exos和Exos-Ber使用低温超速离心法收集，电镜下观察到的形态如图1A所示，Exos具有一个完全薄膜结构，大约125nm大小。装载Ber后结构无明显变化。Exos和Exos-Ber颗粒大小的分布都在125±12nm。Exos-Ber荧光共定位显示DiD标记的外泌体膜具有红色荧光和Ber绿色荧光，合并图像表明Ber已经装载至外泌体中，因为绿色荧光在红色荧光里面（图1C）。WB在Exos和Exos-Ber中都检测到了典型的外泌体标志物的表达。稳定性试验表明在7天内Exos和Exos-Ber都无明显改变，说明药物装载系统稳定（图1E）。此外，冻干前后Exos-Ber的大小和zeta电位无明显变化（图1F）。
2、药物装载，释放，和Exo-Ber的摄取
用超声波将Ber装入Exos中。图2A中，Exo-Ber中Ber含量超声波法(17.13±1.64%)高于孵育法(5.00±0.70%)。随后进行体外释药试验，结果如图2B所示。Exo-Ber在体外表现出缓慢的释放行为。48 h累积释放量为71.44±2.86%。在体外细胞摄取试验中，清楚地观察到，随着时间的推移，Exos被BV2细胞的摄取增加(图2C-2D)。此外，流式细胞术进一步证明了Exos的摄取，并显示出时间依赖性(图2E)。
3、Exo靶向评估
为了验证Exo穿透BBB的能力，作者构建了一个体内SCI模型小鼠，在尾静脉注射Exo-Ber后的1，3，6，12和24h进行体内成像，如图3A所示，对照ReVs显示出自然被动定位，在注射12小时后只有少量聚集在损伤部位，而与此相反，Exos表现出积极的靶向效应，受损部位的荧光强度在在注射3h后显著增加并随着时间逐渐增长。在12h，增长趋势下降，荧光强度在24h到达峰值（图3B）。大脑和脊髓的组织成像进一步证明了Exos的靶向性（图3C）。
图3 体内靶向Exo-Ber
4、体外抗炎效果
巨噬细胞/小胶质细胞体外LPS处理后极化为M1型促炎细胞(表达iNOS)。如图4A所示，LPS组表达强烈iNOS绿色荧光，意味着M1极化，Ber组和Exo组具有相对较弱的绿色荧光，表明它们都可以抑制M1极化。Exo-Ber表现出最弱的绿色荧光，说明具有最好的M1极化抑制效果。M2巨噬细胞/小胶质细胞是抗炎细胞（表达CD206），Exos-Ber诱导小胶质细胞由M1型向M2型转化（图4B）。流式得出和免疫荧光一样的结果（图4C-4D）。促炎因子（TNFα, IL-1β and IL-6）的水平在LPS组最高，相比之下，Ber组和Exo组的水平显著降低，而Exos-Ber组的促炎因子水平最低表明具有最好的抗炎效果（图4E）。
图4表征Exos-Ber在体外抑制M1 BV2细胞激活和促进M2 BV2细胞极化特性
5、Exos-Ber保护神经元并促进SCI后的运动功能恢复
图5A展示了构建模型过程中的SCI小鼠的伤口表面图像。为了评估Exos-Ber治疗效果，使用了BMS得分评估SCI小鼠的运动恢复，如图5B，在第3天和第7日安，只有Exos-Ber组小鼠得分显著升高，并随着时间发展得分越来越高，而其余组则没有显著升高，表面Exos-Ber组具有最好的恢复效果，其小鼠足底频繁且持续站立，但仍不稳定（图5C）。此外，各组小鼠的体重无显著差异，PBS组小鼠体重在伤后一周逐渐恢复，Exos-Ber组伤后1周体重略有下降，后逐渐好转，28 d时体重略有增加。为探讨Exos-Ber对脊髓损伤后运动神经元存活的影响，采用尼氏染色法观察脊髓损伤后运动神经元存活情况。与PBS组相比，Ber组和Exos组的神经元数量增，Exos-Ber组神经元更多，证实了Exos-Ber恢复效果良好（图5E）。为了评估Exos-Ber的安全性，对各种器官和组织(心、肝、脾、肺和肾)进行了HE染色。结果如图5F所示，未发现明显变化，说明Exos-Ber具有生物安全性。
图5 Exos-Ber可以更好的促进SCI后神经元存活和功能恢复和准备工作的安全性评价
6、体内抗炎效果
为探讨Exos-Ber对脊髓损伤后炎症反应的抑制程度，采用Elisa和western blotting检测脊髓组织中IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表达水平，评价损伤部位的炎症反应水平。如图6A和6B所示，与sham组相比，PBS组炎症因子水平显著升高，与PBS组相比，Ber组和Exo组其水平都显著下降，但是和Exo组比较，Exo-Ber组的水平再次下降，表明Exo-Ber抗炎效果最好。随后用免疫荧光检测了巨噬细胞/小胶质细胞的的标记物，发现Exo-Ber抑制M1标记物表达的效果最显著，促进M2标记物的能力也最显著，表明Exo-Ber可以抑制巨噬细胞/小胶质细胞极化。
图6 Exo-Ber可以减轻受损部位炎症反应通过抑制M1巨噬细胞/小胶质细胞激活
随后作者还检测了抗凋亡蛋白（(caspase-9, caspase-8, Bcl-2, BAX, BAX/Bcl-2）以评估Exo-Ber的抗凋亡作用。如图7A所示，与PBS组相比，Exo组，Ber组和Exo-Ber组的这些蛋白表达水平显著下降，表明它们具有抗凋亡作用，而Exo-Ber具有最佳效果。图7Bcleavedcaspase 3/Neun免疫荧光结果也证实了这个结论。
图7 Exos-Ber抑制SCI小鼠的神经元凋亡
总之，在本研究中，作者成功制备了粒径约125 nm的Exos-Ber，封装效率约为17.13%。Exos的自然靶向能力可以实现Ber在损伤部位的高浓度积累。药代动力学实验表明，与Ber溶液相比，Exos-Ber的生物利用度提高了3.2倍。Exos-Ber诱导小胶质细胞过度活化，由促炎M1型小胶质细胞向抗炎M2型小胶质细胞过渡，抑制促炎因子的表达，它还能减少脊髓损伤后的神经元凋亡，促进运动功能恢复。综上所述，Exos-Ber是治疗脊髓损伤较好的抗炎药物。
参考文献：
Gao Zhan-Shan., Zhang Chuan-Jie., Xia Nan., Tian He., Li Dao-Yong., Lin Jia-Quan., Mei Xi-Fan., Wu Chao.(2021). Berberine-loaded M2 macrophage-derived exosomes for spinal cord injury therapy. Acta Biomater, 126(undefined), 211-223. doi:10.1016/j.actbio.2021.03.018