CircIL4R通过miR-761/TRIM29/PHLPP1轴激活PI3K/AKT信号通路，促进结直肠癌的增殖和转移

越来越多的研究表明，circrna (circRNAs)的异常表达广泛参与恶性肿瘤的发生和发展，包括结直肠癌(CRC)。然而，新型circRNA在CRC中的临床意义、水平、特征、生物学功能和分子机制仍有待进一步研究。本研究探讨CircIL4R在结肠癌发生发展中的作用，于2022年11月发表于《Molecular cancer》，IF=15.302。

本文技术路线： 

1. CircIL4R在CRC细胞中被识别
   识别新的致癌circrna有助于了解CRC进展，作者基于公开可用的GEO数据集(GSE126094)进行了生物信息分析，该数据集包括10对CRC组织和ANTs。分析结果显示共有59个明显异常的circrna，其中 23个circrna表达上调，36个circrna表达下调(Fig. 1a)。为了进一步验证这些在CRC细胞株中的表达模式，作者选择了14个候选circrna。结果发现，与FHC细胞比较，新circRNA hsa_circ_0038718在HCT116、DLD1、LoVo、SW620、HT29和SW480 CRC细胞中显著上调；因此，作者将这个circrna作为进一步研究的重点(Fig. 1B)。接下来，基于circBase数据库的注释，研究hsa_circ_0038718的结构。序列分析表明，hsa_circ_0038718是由IL4R基因的第3、4外显子(Chr16: 27，351，506-27，353，580)，长度为227nt；因此，作者在本研究中将其命名为circIL4R(Fig. 1C)。琼脂糖凝胶电泳结果表明，circIL4R仅在cDNA中有扩增，在gDNA中无扩增，证实了CRC中circIL4R呈环形(Fig. 1d)。此外，RNase R酶切检测结果显示，circIL4R mRNA对RNase具有抗性，而线性IL4R mRNA则对R治疗不具有抗性(Fig. 1e)。同样，放线菌素D RNA稳定性分析表明，circIL4R的半衰期比线性IL4R的半衰期更长(Fig. 1f)。随后，通过核-细胞质分离和FISH检测circIL4R的亚细胞定位。结果表明，circIL4R主要定位于CRC细胞的细胞质(Fig. 1g， h)。总之，位于细胞质中的circIL4R在CRC中是一种高度稳定且经常上调的circRNA。

Fig1 CRC细胞中circIL4R的鉴定

2.circIL4R在CRC患者中的表达及其临床意义

为了确定circIL4R在CRC患者中的临床意义，作者首先在一个队列中验证了circIL4R表达情况。FISH染色和qRT-PCR结果检测显示，与ANTs组织相比，CRC组织中circIL4R明显上调，与GEO数据库的生物信息学分析结果一致(Fig. 2a-d)。鉴于circrna高度稳定且不易降解，作者进一步探索circIL4R是否可以用作CRC的诊断和预后生物标志物。作者首先在一组50例CRC患者中检测了circIL4R术前和术后的血清水平。结果显示，术后标本中血清circIL4R较术前标本减少(Fig. 2e)。接下来，作者在另一组40例CRC患者和40例健康受试者中评估了circIL4R的血清表达，发现CRC患者的血清circIL4R明显高于健康受试者(Fig. 2f)。ROC曲线显示表明circIL4R标志物具有良好的CRC诊断价值Fig. 2g)。在此外circIL4R的表达在肿瘤病理分期、T分型、N分型和M分型组中存在差异Fig. 2h-k)。对120例CRC患者生存随访资料进行分析。Kaplan-Meier生存曲线显示circIL4R过表达与预后差呈正相关(Fig. 2l，m)。总之，这些结果提示circIL4R可作为CRC的一种有效的预后标志物和新的治疗靶点。

3.     TFAP2C在CRC中通过转录调控诱导circIL4R的表达

通过JASPAR数据库识别IL4R启动子区域序列的转录因子，TFAP2C因其位于IL4R启动子区域的两个高亲和力响应元件而受到关注，分别命名为TBS1和TBS2(Fig. 3a)。此外，GEPIA数据库的相关分析显示TFAP2C与IL4R呈正相关(Fig. 3b)。然后，作者构建了TFAP2C过表达和干扰质粒，通过qRT-PCR和WB验证TFAP2C在CRC细胞中的相对表达(Fig. 3c， d)。荧光素酶报告基因检测结果表明，在TFAP2C基因敲除后，−1987/−913片段驱动的荧光素酶活性显著降低(Fig. 3h)，而在TFAP2C过表达的细胞中增强(Fig. 3i)。然而，−792/429片段的变化对TFAP2C表达的变化及荧光素酶的活性没有影响(Fig. 3h,i)。这些结果证实了TFAP2C反应位点包含在IL4R启动子−1987/−913区域。接下来，针对IL4R启动子的不同区域设计7对引物(P1-7) (Fig. 3j)。ChIP和定量PCR结果显示TFAP2C与P5-7区域结合。值得注意的是，P5和P6也被称为IL4R启动子中的TFAP2C结合位点1 (TBS1)和TBS2(图3k)。此外，作者在120人的队列中通过qRT-PCR验证了TFAP2C的mRNA表达，应用免疫组化法检测TMAs中TFAP2C蛋白水平。结果显示，与ANTs相比，TFAP2C在CRC组织中的表达显著上调，并与circIL4R呈正相关(Fig. 3l-n)。

Fig 3 TFAP2C通过转录调控增强circIL4R的表达

4.     CircIL4R在体外促进CRC细胞增殖、迁移和侵袭
   为了研究circIL4R在CRC细胞中的生物学功能，作者构建了两个siRNA(si-circIL4R#1和sicircIL4R#)，采用qRT-PCR方法检测circIL4R在不同CRC细胞系(HCT116、DLD1、LoVo、SW620、HT29、SW480)和正常结直肠上皮细胞株(FHC)中的表达情况。结果显示，circIL4R在HCT116和DLD1细胞中表达显著上调，在LoVo细胞中表达相对较低。接下来在HCT116和DLD1细胞来敲除circIL4R，在LoVo细胞中过表达circIL4R，发现对IL – 4R mRNA水平均无影响(Fig. 4a,b)。CCK-8、EdU和集落形成实验表明，下调circIL4R可显著抑制CRC细胞的增殖，而过表达circIL4R则相反(Fig. 4c-h）。这些结果清楚地表明，circIL4R促进CRC细胞增殖。采用Transwell和创面愈合试验检测circIL4R对CRC细胞转移的影响。结果显示，下调circIL4R表达显著抑制了HCT116和DLD1细胞的迁移和侵袭能力。相反，过表达circIL4R显著增强了LoVo细胞的这些能力(Fig. 4i-l）。总之，这些结果表明circIL4R在体外促进CRC细胞增殖、迁移和侵袭。

Fig 4体外circIL4R促进CRC细胞增殖、迁移和侵袭

5.CircIL4R通过PI3K/AKT信号通路促进CRC细胞的侵袭行为

KEGG分析结果显示，circIL4R与PI3K-Akt信号通路显著相关(Fig. 5a)，因此，作者推断circIL4R通过PI3K / AKT信号通路促进CRC发展。结果发现，在HCT116和HCT116中，下调circIL4R基因的表达，显著降低了p-AKT及其下游相关基因的表达水平，PI3K和AKT的总蛋白水平似乎稳定(Fig. 5b)。此外，下调circIL4R对HCT116增殖、迁移和侵袭能力具有抑制作用。740YP（PI3K / AKT信号通路的活化剂）的存在明显减轻了DLD1细胞的增殖、迁移和侵袭能力，而LY294002（PI3K/AKT信号通路的抑制剂）对过表达circIL4R对LoVo细胞增殖、迁移和侵袭能力的刺激作用明显减弱(Fig. 5b)。此外，下调circIL4R对HCT116增殖、迁移和侵袭能力的抑制作用，在740YP作用下过表达circIL4R对LoVo细胞增殖、迁移和侵袭能力的刺激作用明显减弱(Fig. 5c-j)。综上所示，circIL4R通过激活PI3K/AKT信号通路促进CRC细胞的增殖、迁移和侵袭。

Fig 5 circIL4R激活PI3K/AKT信号通路

6.     CircIL4R在CRC细胞中充当miR - 761的海绵
   通过数据库预测到有7个miRNAs (miR-513a-5p， miR-1286， miR-761， miR-3619-5p， miR-214-3p， miR-1184， miR-139-3p)是circIL4R的潜在靶点(Fig. 6a，b)。通过RNA pull-down检测进一步确认circIL4R的结合位点，并通过qRT -PCR验证生物素标记的circIL4R探针(Fig. 6c)。结果表明，在HCT116和DLD1细胞系中，miR-761显著富集(Fig. 6d,e)。为了阐明circIL4R和miR-761之间的相互作用，作者构建了一个包含野生型(WT)或突变型(Mut)序列的荧光素酶报告基因(Fig. 6f)。结果显示，转染miR-761模拟物显著抑制了表达circIL4R的细胞中的荧光素酶活性，而circIL4R Mut报告组细胞表达量无显著差异(Fig. 6g, h)。然后，作者研究了miR-761在120名CRC患者和CRC细胞系中的表达。qRT-PCR结果显示，miR-761在CRC组织中显著下调，且与circIL4R呈负相关(Fig. 6j-l)。此外，miR-761在CRC细胞中表达显著下调(Fig. 6i)。此外，FISH检测结果显示，circIL4R和miR-761在CRC细胞的细胞质中共定位(图6m)。总之，circIL4R可能在CRC细胞中作为miR-761的海绵。

Fig 6 circIL4R在CRC细胞中作为miR-761的海绵

7. TRIM29是miR - 761的下游靶基因

基于四个数据库的交叉分析发现了miR-761靶向的64个候选基因(Fig. 7a)。接下来，作者评估了这些候选基因在结肠癌和直肠癌组织中的表达。在miR-761的预测靶基因中，TRIM29成为作者的主要研究重点，因为与正常组织相比，它在CRC样本中显著上调(Fig. 7b， c)。GEO数据库(GSE87211)得到相同的结果(Fig. 7d)。随后，qRT-PCR检测和WB结果显示，转染miR-761模拟物显著降低了CRC细胞中TRIM29 mRNA和蛋白水平的表达，而转染miR-761抑制剂则引起相反的结果(Fig. 7e, f)。为了进一步阐明miR-761和TRIM29之间的相互作用，作者构建了包含WT或Mut TRIM29 3 ' -UTR的荧光素酶报告基因 (Fig 7g). 荧光素酶报告基因实验表明，转染miR-761模拟物显著抑制了表达TRIM29 WT报告基因的细胞的荧光素酶活性，而在表达TRIM29-MUT的细胞中未检测到显著差异 (Fig. 7h，i)，表明miR-761通过直接结合到3' -UTR的TRIM29降低TRIM29的表达。临床相关结果显示，在120个CRC组织队列中，TRIM29 mRNA表达显著上调，并与miR-761水平呈负相关，与circIL4R水平呈正相关(Fig. 7j-m)。总之，这些发现表明TRIM29是miR-761的直接靶点。

Fig 7 TRIM29是miR-761的下游靶点

8. CircIL4R通过miR - 761/TRIM29轴激活PI3K/AKT信号通路促进CRC进展

TRIM29作为miR-761的下游靶点，已被证实为CRC中的癌基因。因此，作者进一步研究circIL4R和TRIM29的功能。首先，CRC细胞中干扰或过表达TRIM29。CCK-8、集落形成、Transwell和创面愈合实验证实过表达TRIM29促进CRC细胞的增殖、迁移和侵袭，而敲低TRIM29则表现出相反的效果(Fig. 8a-d)。更重要的是，作者观察到过表达TRIM29可以抑制circIL4R敲除引起的HCT116细胞增殖、迁移和侵袭能力的抑制，而敲除TRIM29可以在很大程度上抑制circIL4R过表达引起的LoVo细胞的恶性进展(Fig. 8a-d)。作者进一步研究了circIL4R是否通过miR-761/TRIM29轴激活PI3K/AKT信号通路。WB检测结果显示，在HCT116细胞中，circIL4基因下调导致的p-AKT水平降低可以被TRIM29的过表达逆转(Fig. 8e)。 相反，过表达circIL4R诱导的p-AKT水平的上调可以通过下调TRIM29来抑制(Fig. 8e)。综上所述，circIL4R在促进PI3K/AKT信号通路激活和调控CRC恶性进展中的作用在很大程度上依赖于miR-761/TRIM29轴。

已知肿瘤抑制因子PTEN、PP2A和PHLPP1可抑制PI3K/AKT通路的活性。然而抑制或过表达TRIM29均不改变PTEN和PP2A的表达(Fig. 8f)。TRIM29敲低可上调PHLPP1的蛋白表达，过表达TRIM29则相反；对PHLPP1 mRNA水平无显著影响(Fig. 8f,g)。 WB分析显示，TRIM29基因敲除可抑制p-AKT水平。si-TRIM29和si-PHLPP1共转染逆转了这种效应，反之亦然(Fig. 8h)。作者推测TRIM29也可以过泛素化修饰PHLPP1激活PI3K/AKT途径通。为了证实这一假设，作者首先用抗TRIM29和抗PHLPP1抗体进行了共免疫沉淀试验，以检测TRIM29是否与PHLPP1相互作用。结果验证了内源性TRIM29和PHLPP1蛋白在HCT116细胞中的相互作用(Fig. 8i)，在过表达TRIM29的HCT116细胞中，PHLPP1的半衰期明显降低(Fig. 8j)，提示TRIM29可以介导PHLPP1蛋白的降解。此外，TRIM29对PHLPP1的调控可被蛋白酶体抑制剂MG132调控(Fig. 8k)， 这进一步说明其调控可能源于泛素化过程。更重要的是，泛素化实验显示，在HCT116细胞中，TRIM29敲除后PHLPP1泛素化减少，而TRIM29过表达则导致相反的效果(Fig. 8l)。总之，这些发现表明circIL4R可能激活PI3K/AKT信号通路通过trim29介导的泛素化和随后的PHLPP1降解。

Fig 8 circIL4R通过circIL4R/miR-761/TRIM29/PHLPP1轴促进CRC进展

9. CircIL4R在体内促进CRC细胞增殖和转移

为了进一步验证circIL4R在体内对CRC细胞增殖的影响，在HCT116和DLD1细胞中稳定转染circIL4R 敲低(sh-circIL4R)或阴性对照(sh-Ctrl)（Fig. 9a），然后通过慢病毒包装注入BALB/c裸鼠体内。结果显示，下调circIL4R显著抑制了两种HCT116和DLD1细胞的肿瘤生长(Fig. 9b,c)。此外，与对照组相比，sh- circil4r组肿瘤的体积和重量明显减少(Fig. 9d,e)。免疫组化染色显示，下调circIL4R可降低Ki-67、TRIM29和p-AKT的表达水平，提高PHLPP1的表达水平(Fig. 9f)。此外，将荧光素标记的CRC细胞注射到裸小鼠尾静脉，以确定circIL4R是否能在体内促进CRC细胞的转移(Fig. 9g)。结果显示，circIL4R基因敲除显著降低了小鼠肺部的荧光强度和转移性结节的数量(Fig. 9h-j)。Kaplan-Meier生存曲线显示，与阴性对照组相比，circIL4R敲除组裸鼠的总生存期更长(Fig. 9k,l)。这些结果与体外实验一致，证实了circIL4R在体内可促进CRC的恶性进展。

Fig 9 circIL4R在体内促进CRC细胞的肿瘤发生和转移

本研究首次证明circIL4R在CRC细胞、组织和血清中的表达显著增加，并可作为诊断和预后的生物标志物。此外，TFAP2C通过转录调控诱导circIL4R表达，且circIL4R过表达与miR-761竞争性相互作用，增强TRIM29的表达，从而靶向PHLPP1进行泛素介导的降解，激活PI3K/AKT信号通路，促进CRC的进展。

参考文献：

Jiang, T., et al., CircIL4R activates the PI3K/AKT signaling pathway via the miR-761/TRIM29/PHLPP1 axis and promotes proliferation and metastasis in colorectal cancer. Mol Cancer, 2021. 20(1): p. 167.