心律失常性心肌病的潜在新疗法：crenolanib药物抑制PDGFRA

FLNC截断突变（FLNCtv）是遗传性扩张型心肌病（DCM）的常见病因，是发展成心律失常性心肌病的高危因素。本研究结果表明，PDGFRA信号通路与DCM发病机制有关，抑制该通路可能是flnc相关心肌病的一种治疗策略本研究于2022年2月发表在《Science Advances》IF:14.136杂志上。

技术路线：

主要研究结果：

1、使用患者特异性多能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）构建FLNC-相关DCM模型

作者从FLNC^G1891Vfs61X和FLNC^CE2189X的DCM患者身上分离出iPSC细胞，然后诱导成iPSC-CMs，并探究其电生理学属性，结果显示与健康对照组相比，FLNCtv患者的iPSC-CMs均表现出较弱的收缩性和较慢的放松性（Fig. 1 A and B）。两种患者特异性iPSC-CMs也表现为自发性心律失常（Fig. 1 C）。与对照组iPSC-CMs相比，心律失常表型也表现为心率的较大变异（Fig. 1 D）。为了进一步验证心律失常的表型，检测了健康和iPSC-CMs患者的动作电位(AP)形态。与收缩数据一致，40%的FLNC^G1891Vfs61X和36%的FLNC^CE2189X 的iPSC-CMs与对照iPSC-CMs相比出现异常AP形态（Fig. 1 E and F）。总之，这些数据表明，FLNC患者iPSC-CMs概述了体外与FLNC相关的DCM相关的心律失常表型。

图1 FLNC^G1891Vfs61X and FLNC^E2189X iPSC-CMs 表现出收缩性受损和心律失常

2、FLNC^G1891Vfs61X和FLNC^CE2189X都是缺失突变体其导致FLNC相关心肌病的单倍机能不全

接下来检测了患者特异性iPSC-CMs中FLNC的表达水平，通过免疫印迹和qPCR检测发现，与对照组iPSC-CMs相比，FLNCG1891Vfs61X和FLNCCE2189X突变体表达FLNC蛋白和mRNA水平均显著降低（Fig. 2 A to C）。尽管FLNC表达水平降低，但通过免疫荧光染色和共定位分析，能够在两个FLNC突变的iPSC-CM细胞系中检测到FLNC及其与α- actitin在Z-discz盘的共定位（Fig. 2D）。

为了探究FLNCG1891Vfs61X和FLNCCE2189X是否是功能丢失的突变体，为FLNC缺失的iPSC系和等基因对照系细胞生成了差异表达基因(DEG)谱，并与iPSC- CMs患者的DEG谱进行了比较。结果显示成功构建了FLNC纯合子（FLNCKO−/−）和杂合子（FLNCKO+/−）敲除的iPSC-CMs（Fig. 2 E to H）。FLNCKO−/−和FLNCKO+/−iPSC-CMs中FLNC的表达在mRNA和蛋白水平上均以等位基因依赖的方式显著降低。RNA测序生物信息学分析显示，FLNC截断突变中的DEGs与FLNC KO iPSC-CMs中的DEGs呈正相关，支持功能缺失是FLNC突变引起表型表现的主要机制（Fig. 2I）。此外，携带FLNC突变的iPSC-CMs显著降低了ID蛋白水平；FLNC KO iPSC-CMs也有相同的发现（Fig. 2J）。最后，FLNCKO−/−细胞表现出与患者iPSC-CMs相似的心律失常表型（Fig. 1 E and F）。总之，这些结果说明FLNCG1891Vfs61X和FLNCCE2189X都是缺失突变体其导致FLNC相关心肌病的单倍机能不全。

图2 FLNC^G1891Vfs61X and FLNC^E2189X的功能缺失突变导致FLNC相关心肌病的单倍机能不全

3、FLNC缺失导致β-Catenin核定位和β-Catenin信号通路的激活

为了发现FLNC的分子伴侣，进行了共免疫沉淀和蛋白质组学分析，通过蛋白质组学分析确定了β-Catenin，经免疫印迹证实（Fig. 3A）。在FLNC^KO−/− iPSC-CMs的裂解液中没有检测到β-Catenin，而且在FLNC突变的iPSC-CMs的裂解液中β-Catenin的水平也减少了（Fig. 3A）。此外，在FLNC -突变体和FLNC^KO−/− iPSC-CMs的细胞核中检测到大量的β-Catenin，而对照iPSC-CMs中β-Catenin主要在细胞质中检测到（Fig. 3B-C）。此外，FLNC -突变体和FLNC^KO−/− iPSC-CMs的RNA-seq数据表达谱显示β-Catenin信号通路激活（Fig. 3D）。总之，数据表明β-Catenin可能是一种新的FLNC结合伙伴和FLNC的下游效应物，并且iPSC-CMs中FLNC的缺失导致β-Catenin从胞浆迁移到细胞核，导致β-Catenin信号的激活。

图3 β-Catenin与FLNC和FLNC激活的β-Catenin信号通路的缺失有关

4、PDGFRA在FLNC相关心肌病中上调并且是β-Catenin的下游调控因子

为鉴定更多的下游靶点用于药物开发，作者比较了FLNC^KO−/−和FLNC^KO+/−的iPSC-CMs的转录组以鉴定潜在靶基因。如图Fig. 4A所示，FLNC^KO−/−和FLNC^KO+/−的iPSC-CMs的转录组有接近相似的上调和下调DEGs。对两者间共有的上调和下调DEGs进行KEGG分析，发现它们主要参与调控cell-cell adhesion, intercellular communication，ion transport等通路（Fig. 4B to D）。此外，这些上调的DEGs主要富集至PDGF分子水平的结合活性（Fig. 4E）。数据显示，与等基因对照的iPSC-CMs相比，FLNC KO系中PDGFRA的表达水平显著提高了4倍（Fig. 4F）。由于数据表明，FLNC^G1681Vfs61X和FLNC^E2189X突变导致单倍功能不全，作者假设携带这些突变的iPSC-CMs患者的PDGFRA水平也可能升高。如Fig. 4G to H所示，与对照组相比，两种患者来源的iPSC-CMs中PDGFRA均上调。总之，这些发现提示PDGFRA信号通路的激活与FLNC相关心肌病的发病机制有关。

图4细胞粘附途径的失调导致PDGFRA在FLNC相关心肌病发病机制中的激活

β-Catenin被认为可以上调PDGFRA在其他组织和/或疾病中的表达。由于观察到β-Catenin在FLNC缺失的iPSC-CMs中有显著的核定位，于是研究了β-Catenin是PDGFRA上游转录激活因子的假设。因此，使用β-Catenin抑制剂(JW67和JW74)在不同浓度下抑制β-Catenin，并观察到PDGFRA转录水平的剂量依赖性抑制（Fig. 5A）。此外，ChIP下拉实验表明，已知的转录因子和β-Catenin结合伙伴SOX2与PDGFRA启动子区结合（Fig. 5B）。总之，数据表明β-Catenin是PDGFRA的转录激活因子，并且β-Catenin的核定位导致PDGFRA在FLNC缺失的iPSC-CMs中持续上调。

图5 β-Catenin可能是PDGFRA的转录激活因子

5、PDGFRA抑制挽救了connexin 43的膜定位

研究显示PDGFRA通过激活MAPK/ERK信号通路，破坏细胞膜上connexin43（缝隙连接蛋白-1 (GJA1)）的信号。作者发现，与对照iPSC-CMs相比，FLNC突变体和KO iPSC-CMs的ERK激活并且GJA1离开细胞膜（Fig. 6A）。为了测试FLNC单倍不足的iPSC-CMs中PDGFRA的激活是GJA1定位错误的原因，使用FDA批准的药物crenolanib对PDGFRA进行药物抑制，以确定对GJA1膜定位的影响。免疫荧光研究表明，crenolanib抑制PDGFRA可以挽救GJA1在膜上的定位（Fig. 6A）。

转录组分析显示，与FLNCG1891Vfs61X和KO iPSC-CMs相比，FLNCE2189X突变体iPSC-CMs对crenolanib的反应最大，拯救的DEGs数量最多（Fig. 6B）。GSEA揭示了细胞粘附途径(hsa04510)的部分正常化，支持了cell-cell adhesion位点的结构稳定促进了GJA1粘附在细胞膜上的假设（Fig. 6C）。然而，通过免疫印迹检测，发现crenolanib处理后GJA1的表达水平没有改变，这表明PDGFRA抑制并不影响GJA1的表达水平，而是影响GJA1的转运（Fig. 6D）。最后，也是最重要的一点是，crenolanib处理也显著改善了来自FLNC患者的iPSC-CMs的收缩性，并减少了心律失常，但对健康对照组而言并非如此（Fig. 6E-F）。综上，说明FLNC缺失导致细胞-细胞黏附系统失调，抑制PDGFR信号通路改善FLNC突变体iPSC-CMs的收缩性.

图6 FLNC缺失导致细胞-细胞黏附系统失调，抑制PDGFR信号通路改善FLNC突变体iPSC-CMs的收缩性

6、PDGFRA抑制减弱了β-catenin核定位

通过免疫荧光检测到，与对照组iPSC-CMs相比，FLNC突变体iPSC-CMs中β-catenin的核定位增加，但在crenolanib处理后，β-catenin的核定位减少（Fig. 7A）。qPCR证实crenolanib处理对β-catenin核信号转导的抑制作用，β-catenin靶基因TCF4、SOX9、COL1A2、TGF 3的转录水平降低（Fig. 7B）。此外，通过GSEA分析比较crenolanib治疗前后患者源性和KO iPSC-CMs的DEGs谱，进一步证实PDGFRA信号抑制后β-catenin信号通路部分恢复（Fig. 7C-D）。因此，证据表明PDGFRA的激活增强了β-catenin信号，并促进了一个正反馈回路。此外，PDGFR抑制可以部分恢复β-catenin膜定位，减少FLNCtv突变引起的β-catenin的激活。

图7 PDGFRA抑制减缓了β-catenin信号通路及其在FLNC突变体iPSC-CMs中的核定位

7、a-DCM中PDGFRA信号的激活

为了证实体外研究的结果，测定了a-DCM患者心脏中PDGFRA的表达水平。在a-DCM患者中(n = 5)， 1例患者是FLNC^G1891V61X突变的姐妹。另外4例患者诊断为特发性DCM合并室性心律失常。发现a-DCM患者心脏PDGFRA水平升高， PDGFRA下游效应物ERK被激活（Fig. 8A and B）。此外，还确定了β-catenin和GJA1在DCM心脏中的表达水平和定位。虽然β-catenin和GJA1的表达水平结果保持不变，但免疫荧光染色检测到β-catenin和GJA1从细胞膜上分离（Fig. 8C and E）。此外，移植心脏的RNA-seq数据显示，与DCM (n = 15)和未衰竭心脏(n = 12)相比，a-DCM (n = 20)心脏中PDGFRA mRNA的丰度显著更高（Fig. 8F）。RNA-seq数据经qPCR验证，如Fig. 8G所示。此外，各组间PDGFRB mRNA转录水平未发生变化，提示FLNC突变引起a-DCM的致病机制是特异性于PDGFRA亚型的（Fig. 8F）。总之，证实了来自患者特异性和KO iPSC-CM系和人类a-DCM移植心脏的体外发现，强烈表明PDGFRA促进a-DCM的致病信号传导。

图8 PDGFRA的上调有助于GJA1和β-catenin在心律失常性扩张型心肌病心脏的离域

总之，如图9，本研究发现β-catenin是FLNC的下游靶点，FLNC单倍不足不仅影响cell-cell adhesion、细胞骨架和肌肉组织，还增加β-catenin的核迁移，进而上调PDGFRA的转录。随后PDGFRA信号的激活可能是FLNC突变体iPSC-CMs中观察到的收缩功能障碍和电不稳定的原因。FLNC 单倍不足和随后PDGFRA激活引起的心律不齐的表现型至少部分是由于GJA1位移引起的细胞膜的几种机制导致的，如PDGFRA下游靶点ERK磷酸化，ID中断和异常易位。

图9 FLNC相关心肌病的疾病模型

参考文献：

Chen Suet Nee., Lam Chi Keung., Wan Ying-Wooi., Gao Shanshan., Malak Olfat A., Zhao Shane Rui., Lombardi Raffaella., Ambardekar Amrut V., Bristow Michael R., Cleveland Joseph., Gigli Marta., Sinagra Gianfranco., Graw Sharon., Taylor Matthew R G., Wu Joseph C., Mestroni Luisa.(2022). Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Adv, 8(8), eabk0052. doi:10.1126/sciadv.abk0052