通过IL6/JAK2/STAT3信号通路靶向小胶质细胞极化表型能减少NSCLC脑转移

肿瘤相关的巨噬细胞已经成为转移的关键因素。小胶质细胞是脑微环境不可或缺的组成部分，在脑转移 (brain metastasis, BM) 中发挥着重要作用。然而，活化的小胶质细胞促进非小细胞肺癌(NSCLC)脑转移的潜在机制尚不清楚。本研究纯化了具有脑转移倾向的细胞系，并利用共培养系统揭示了它们与小胶质细胞的通信。本文于2022年2月发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》，IF=13.493。

本文技术路线：

本文主要内容：

1. 脑转移微环境下小胶质细胞表型的改变

为了探讨小胶质细胞在非小细胞肺癌脑转移中的作用，我们首先评估了几种常用的EGFR野生型非小细胞肺癌细胞株(A549、H460、H292和H1299)的转移能力(Fig 1a,b)。其中，A549细胞的侵袭和迁移能力最强，因此选择A549细胞进行进一步研究。我们将A549细胞心内接种裸鼠，建立脑转移模型。将转移组和未接种对照组小鼠脑组织进行Iba-1染色，分析小胶质细胞的分布情况。与对照组相比，治疗组脑转移灶可见大量形态改变、树枝状化增强的小胶质细胞(Fig 1c)。同样的，人NSCLC-BM标本Iba-1免疫组化染色显示，活化的小胶质细胞浸润于BM病灶附近(Fig 1d)。

为了研究NSCLC细胞与小胶质细胞的相互作用，我们进行了体外细胞实验，用A549细胞(ACM)条件培养液(CM)刺激小胶质细胞，观察其对不同时间点小胶质细胞形态的影响。24 h和48 h后，植株形态发生明显变化，分枝形态转变为丛生形态（Fig. 1e）。

为阐明ACM对特异性小胶质细胞活性的影响，用qRT-PCR分析了促炎M1标志物(iNOS和CD86)和抗炎M2标记物(CD206和ARG1)的表达。NOS和CD86的表达在12 h 上调， CD206、Arg1表达水平在24 h、48 h也上调了(Fig. 1f)。Western blot结果显示，HMO6细胞在0 h时几乎检测不到iNOS和CD206水平，提示小胶质细胞处于静止状态(Fig 1g)。所有结果在NSCLC-BM患者样品中中一致反映为CD206+小胶质细胞明显多于iNOS+小胶质细胞(Fig 1h)。

Fig1 人NSCLC A549细胞中小胶质细胞表型改变

2. 抗炎小胶质细胞的脑转移瘤促进非小细胞肺癌细胞定植

免疫荧光分析显示，TGF-β1降低了E-cadherin在细胞突出连接处的表达，上调了vimentin的表达，而共培养CM (co-HCM和co-CCM)可以逆转这一过程(Fig. 2a,b)。为了进一步验证这些观察结果，我们进行了qRT-PCR和western blot分析。结果表明，CM共培养可诱导间充质样A549细胞和H292细胞MET(图2c-f)，E-cadherin上调、vimentin下调。这些结果表明，抗炎小胶质细胞足以对癌细胞进行重组，以获得上皮表型，并促进转移性定植。

Figure 2．M2 -小胶质细胞CM促进NSCLC细胞定植

3. 单细胞测序显示A549细胞BM中存在激活的小胶质细胞

为了进一步阐明非小细胞肺癌BM细胞与激活的小胶质细胞之间的细胞通信的潜在机制，我们首先通过将A549细胞接种到雄性BALB/c nu/nu小鼠左心室中获得了高脑转移性NSCLC细胞(Fig 3a)。分别经过第一轮、第二轮和第三轮体内获得提取的细胞A549-F1、A549-F2和A549-F3。值得注意的是，BM的发生率随体内选择数量的增加而增加，A549-F3细胞最终BM的发生率最高(63.6%；7/11)。BM发生率从F0时的10.0%增加到F1时的28.6%，在F0时增加到50.0% (Fig. 3b)。

为了表征激活的小胶质细胞参与脑转移定植的特征，我们通过单细胞RNA-seq对小胶质细胞进行分类，并使用指数排序策略分析了转移组和健康组大脑中细胞簇的差异，从而可以回顾性分析每个单个细胞的表面标记组合(Fig 3c)。共鉴定28165个细胞，其中A549-BM有11305个，A549-F3-BM有10459个，来自正常大脑组织的6401个。

接下来，我们分析了20个细胞群（0-19）(Fig. 3d)。绝大多数细胞为小胶质细胞(簇0,1,2,3,5,9,10,16,17，19)，大多数细胞簇在A549和A549-f3细胞转移病灶之间重叠(Fig 3e、f)。我们通过HeatMap随机选择100个细胞，分析了每个集群中差异基因的前10个，结果显示，A549和A549- 3组中以特征性抗炎小胶质细胞为主，而对照组中抗炎和促炎小胶质细胞数量相近，维持平衡状态(Fig 3g)。KEGG通路分析脑转移瘤中小胶质细胞重叠簇。结果表明，JAK/STAT通路及其他几个通路均显著上调(Fig 3h)。已知JAK/STAT通路的上调与TAM的激活有关。在这些结果的基础上，我们在体内证实了M2小胶质细胞在NSCLC-BM中的存在。

Figure 3 单细胞RNA-Seq揭示转移性病变中活化的小胶质细胞

4. IL6在脑脊髓炎中作为A549-F3和M2小胶质细胞通讯的中介

比较转录组芯片分析被用来比较A549-F3细胞、A549-F0细胞与HMO6小胶质细胞与亲本A549细胞共培养时的高转移性基因的全基因组表达谱。结果显示，脑脊髓瘤衍生的差异表达基因(DEGs)有4857个A549-f3细胞，共培养的A549细胞中有1769个DEGs (Fig. 4a,b)。为了进一步优选候选基因，我们在标准化数据的基础上，使用两组基因芯片进行相关分析，得到维恩图(Fig 4c)。对前30个DEGs进行进一步分析(Fig.4d)。在A549-F3及共培养细胞中，IL6上调最显著(Fig 4e)。

qRT-PCR和Western blot结果证实A549-f3和共培养的A549细胞中IL6表达升高(Fig 4f,g)。此外，ELISA检测显示与A549细胞培养相比，A549- F3细胞中IL6水平较高(Fig 4h)。为了证实IL6对BM的影响，将A549-F3/mock或IL6/敲除细胞注射到裸鼠体内（Fig 4i)。四周后，利用体内BLI信号检测转移活性。il-6的下调降低了BM的发生率，从58.3%(7 / 12)降至38.5%(5 / 13)，转移病灶的光子通量也较弱(Fig. 4j,k)。这些结果提示了IL6在A549-F3 BM中的重要性，并提示了IL6相关信号的参与。

Figure 4   IL6是BM中A549-F3和M2小胶质细胞通讯的中介

5. IL6/JAK2/STAT3信号通路介导小胶质细胞M2极化

在添加F3-CM或iL- 6的培养基中加入不同浓度的托珠单抗后，HMO6和CHME5细胞中CD206和Arg1的表达水平下降(Fig 5a). 接下来分析JAK/STAT通路成员如JAK1、JAK2、STAT3和STAT1的表达水平。发现可以通过添加IL6或F3-CM刺激HMO6或CHME5细胞，而在托珠单抗治疗的情况下磷酸化的JAK2和STAT3水平均降低(Fig 5b）。为研究M2极化中的JAK2/STAT3 信号，我们用JAK2抑制剂菲卓替尼治疗HMO6或CHME5细胞。不出所料，在IL6或菲卓替尼存在的情况下，JAK2/STAT3活性被抑制(Fig 5c），综上所述，这些结果表明F3-CM诱导的M2极化需要IL6/JAK2/STAT3信号的激活。随后，我们研究了STAT3是否可以直接调控ARG1或CD206的表达。使用生信软件来预测和鉴定ARG1基因含保守的STAT3结合位点的启动子区域包，我们选择最保守的结合位点(#1)进行详细分析（Fig 5d）。STAT3的过表达导致肿瘤的ARG1-promoter-WT报告基因表达增加，但未增加ARG1-promoter-MT报告基因的表达(Fig 5e)。接下来，在CHME5细胞中进行染色质免疫沉淀(ChIP)-PCR分析，以确定ARG1启动子激活的精确序列。免疫沉淀后，推测的STAT3结合位点(-1108 ~ -1098 bp)显著富集，而阴性对照IgG抗体则无明显条带(Fig 5f)。qRT-PCR结果显示，在CHME5细胞中，蛋白/ARG1基因复合物被抗STAT3抗体拉下(Fig 5g)。总之，ARG1可能是STAT3的潜在靶基因，介导il6诱导的M2极化。

Fig 5. IL6/JAK2/STAT3信号通路介导小胶质细胞M2极化

6. 靶向IL6/JAK2/STAT3信号通路能抑制A549-F3体内转移

体外数据表明IL6在M2极化中的关键作用，于是作者提出抑制IL6是否可以抑制小胶质细胞中JAK2/STAT3信号通路的活性，从而降低A549-F3脑转移的问题。将裸鼠分成四组，将A549-F3细胞注入左心室建立骨髓。此后，四组小鼠均给予托珠单抗(5mg /kg)腹腔注射，每周1次，每日给予PLX5622(抑制剂与磷酸盐缓冲盐水联合)12000 mg/kg治疗，注射PBS作为对照。实时成像显示，托珠单抗治疗组BM发生率为38.5%(5 / 13)，对照组为70.0%(7 / 10)，而联合治疗组BM发生率高于托珠单抗治疗组(50.0%，5 / 10) (Fig 6a, b)。与此结果一致的是，转移灶的总BLI信号强度在单抗治疗组是最低的(Fig 6c)。在结束时，治疗组BM负担显著低于对照组(45.5%[5 / 11]，而对照组为70% [7 / 10])，并伴有转移灶较低的发光(Fig 6d-f).

为了进一步证实IL6在NSCLC-BM中的临床价值，采集了120例非NSCLC患者的外周血标本，并评估了血清IL6水平预测BM的可行性。根据IL-6水平分为两组(n = 120)。随访28个月后，分析两组脑脊髓炎的差异。结果发现两组有不同的脑转移率，iL-6水平较高的组有更高的脑转移风险 (Fig 6g). 虽然由于随访时间有限，无法获得生存数据，但TCGA数据显示IL6水平低的NSCLC患者(n = 318，中位生存时间=21.87个月)的总生存期长于il - 6高的患者(n = 314，中位生存时间= 26.33个月;P = 0.0006) (Fig.6h)。

Fig6 靶向IL6/JAK2/STAT3信号通路抑制A549-F3体内转移

本研究阐明了脑转移细胞(A549-F3)和活化的M2 -小胶质细胞之间的相互交流机制。强调了NSCLC-BM中IL6是BM发生的一个预后因素，也是一个潜在的预防治疗靶点。提出可以通过IL6/JAK2/STAT3信号通路调控小胶质细胞表型，探索了新的潜在的预防和治疗方法。

参考文献：
Jin, Y., et al., Targeting polarized phenotype of microglia via IL6/JAK2/STAT3 signaling to reduce NSCLC brain metastasis. Signal Transduct Target Ther, 2022. 7(1): p. 52.