尼鲁单抗可提高PD-1+处理的人结肠癌细胞的存活率，并可保护肿瘤细胞免受传统疗法的伤害

结直肠癌(CRC)是世界范围内最常见、最致命的肿瘤之一。大多数的CRC对以抗程序性细胞死亡蛋白-1 (PD-1)为基础的癌症免疫治疗耐药。约15%具有高微卫星不稳定性、高肿瘤突变负担和肿瘤内淋巴细胞浸润。肿瘤相关的巨噬细胞已经成为转移的关键因素。PD-1信号通路激活致癌功能，而在肺癌细胞中，它具有肿瘤抑制作用。本研究工作旨在评估抗PD -1 尼鲁单抗 (NIVO)药物治疗CRC的效果。本研究于2022年3月发表于《Journal for Immuno Therapy of cancer》，IF=13.751。

本文技术路线：

本文主要内容：

1. PD-1阻断增加结肠癌细胞生长

首先，在人结肠癌细胞中评估PD-1和PD-L1水平。在HT29、HCT116、LoVo、SW620和Colo205细胞中检测到PD-1，但未检测到PD-L1 (Fig 1A)。与SW620和Colo205细胞相比，HT29、HCT116和LoVo细胞明显过表达PD-1。已有研究表明，当IFN诱导PD-L1时，I型(IFN-α)和II型(IFN-γ)干扰素带来的影响取决于PD-1和PD-L1的表达。在HT29和HCT116细胞蛋白水平和转录组水平上，IFN-α和IFN-γ均不能诱导PD-1，而IFN-α和IFN-γ均能诱导PD-L1 (Fig 1B)。为评估细胞PD-1信号通路在结肠癌细胞凋亡和细胞生长中的作用。人结肠癌细胞 HT29、HCT116和LoVo用可溶性PD-L1和 NIVO进行处理。如Fig 1C所示，sPD-L1增加了HT29、HCT116和LoVo细胞凋亡。如Fig 1D所示，NIVO促进了细胞增长，而sPD-L1抑制了其生长。 在HT29和HCT116细胞中，六个小时NIVO(10 μM)处理诱导pERK表达，但是NIVO (10 μM)降低了人黑色素瘤细胞PES43的pERK (Fig 1E)。

此外，6小时NIVO(10 μM)增加了HT29中pP38的含量，但NIVO对K-RAS突变细胞HCT116中的pP38无影响(Fig 2C)。相反， 6小时NIVO(10 μM)处理减少了PES43中pP38水平，这些数据表明PD-1通过抑制P38和ERK信号通路抑制细胞增殖。

为了进一步研究下游信号通路在PD-1介导的细胞增殖中的作用，作者在MEK/ ERK1/2/AKT/P38抑制剂存在下评价HT29和HCT116细胞的生长，结果发现，激酶抑制剂显著恢复了NIVO诱导的HT29细胞的生长。在HCT116中，AKT和MEK/ERK1/2抑制剂都能恢复NIVO诱导的细胞生长，而正如预期的那样，P38抑制剂不影响细胞增殖。

Fig 1 PD-1阻断增加结肠癌细胞生长

 
2.NIVO保护结肠癌细胞免受化疗/放疗伤害，并增强球状生长

为了研究PD-1信号通路对化疗的影响，作者在 NIVO存在的情况下，用5-FU、OXA、CDDP、DOXO、IRI和TAX治疗人结肠癌细胞72小时。结果发现，NIVO 降低了化疗疗效，增加了HT29、HCT116和LoVo的5-FU、OXA和IRI水平。此外，在HT29、HCT116和LoVo细胞中，5-FU和OXA加入NIVO后，细胞凋亡率降低(Fig 2A)。

NIVO存在的HCT116和HT29细胞暴露于2-4-8 Gyx射线中(Fig 2B i)。在HT29和HCT116细胞中，NIVO增强了对辐射的抵抗力，促进细胞生长(Fig 2B i)。NIVO- f (ab)2 (1μM)处理与NIVO处理效果相同(Fig 2B ii)。

此外，为了重现肿瘤细胞的三维相互作用和相对药物敏感性，将人结肠癌细胞HT29、HCT116和SW620在球体和NIVO/中进行三维培养评价NIVO + OXA疗效。从图2C中可以看出，在HT29种用NIVO处理(10 μM)增强了HT29的球体平均面积，而在HT29、HCT116、HT29OXA、SW620中处理显著减少了的球体平均面积。总之，NIVO抑制了OXA对HT29和HCT116球形细胞生长的影响，但对低表达PD-1的SW620细胞无影响。

Fig2 NIVO保护结肠癌细胞免受化疗/放疗伤害，并增强球状生长

3. NIVO诱导人结直肠癌细胞差异基因表达

对HT29 和HCT116细胞用NIVO、sPD-L1、sPD-L1+NIVO进行6-24小时NIVO处理，并与PES43细胞比较，进行RNA测序。确定结肠癌细胞中治疗影响的基因。如图3A中的主成分分析(PCA)所示，HCT116、HT29和PES43独立的聚为3类。6个小时的处理后，在PES43，HT29和HCT116中发现8306，618和3846个差异表达基因。24个小时的处理后，在PES43，HT29和HCT116中发现73121147和5410个差异表达基因。

作者重点研究了HT29、HCT116和PES43中共同调控的基因，分别在NIVO治疗6小时和24小时后发现了149个和299个共同基因(Fig 3C)。在NIVO治疗6小时和24小时时分别筛选19个(NIVO-6小时)和67个(NIVO-24小时)与PES43相关(Fig 3D)。

在处理6小时时，BATF2， IFIT3和TNFRSF11A在PES43中表达上调(Fig 4)。因此，6小时的NIVO治疗可能会影响HT29和HCT116的基因表达，使HT29和HCT116具有更强的侵袭性表型，而PES43具有较弱的侵袭性表型，肿瘤抑制因子的减少和先天免疫反应、1-IFN信号通路和细胞因子介导的信号通路的调控基因相关，这些特征在治疗24小时内保持不变(Fig 4)。在处理6个小时和24个小时的HT29和HCT116细胞中中分别筛选12个基因进行 qRT-PCR验证，得到相同的结果。

Fig3 NIVO处理的人类结肠癌和黑色素瘤细胞中的差异表达基因(DEGs)

Fig4 Nivo处理的人类结肠癌和黑色素瘤细胞中差异表达基因(DEGs)的Go富集分析

4. NIVO增强HT29肿瘤的体内生长

以HT29异种移植模型评价NIVO效应。将HT29细胞接种于CD1胸腺病小鼠，当肿瘤达到50 mm3时，将小鼠随机分为四组，每周两次腹腔注射PBS (n=6)、NIVO (n=6)、OXA (n=6)以及NIVO +OXA联合(n=6)治疗3周。用HE评估肿瘤组织学。与体外实验一致，NIVO显著增加肿瘤生长1.88倍(Fig 5A)，提示PD-1阻断可促进肿瘤生长，降低化疗疗效。同样，与对照组相比，NIVO组肿瘤体积增大(Fig 5B)。与未处理组和与OXA联合组相比，NIVO显著增加了Ki-67表达细胞的比例(p=0.023) (p=0.027) (Fig 5C)。此外，NIVO和cleaved caspase-3检测结果显示，NIVO + OXA显著降低了凋亡细胞的比例。此外，nivo处理的肿瘤与未处理的肿瘤相比，P38表达水平更高。有趣的是，在OXA处理的肿瘤中，pP38阳性细胞显著降低(p=0.0061)，而在NIVO + OXA处理的肿瘤中，pP38阳性细胞增加(p=0.0047)，表明NIVO处理的肿瘤中细胞增殖更高。此外，与OXA治疗组相比，OXA + NIVO组pERK1/2显著升高。

癌症基因组图谱(TCGA)数据库显示，PD-1编码的PDCD1基因在包括CRC在内的17种癌症中被广泛转录。然而，结肠癌组织中有浸润的淋巴细胞。通过免疫组化分析48份石蜡包埋的结肠癌样本中PD-1的表达情况。PD-1在TME和癌细胞中表达。临床病理特征显示原发性肿瘤的大小与PD-1的表达显著相关，而且PD-1主要在结肠癌黏液组织中表达。

Fig5 PD-1阻断加速皮下HT29肿瘤生长，降低化疗疗效

本提供了第一个PD-1靶向导致结肠癌放射/化疗耐药的报告。肿瘤细胞固有的PD-1/总PD-1表达可能代表CRC患者免疫检查点阻断选择的潜在生物标志物。PD-1在结肠癌中的表达可促进肿瘤细胞生长，促进肿瘤生长。

参考文献

Ierano, C., et al., In PD-1+ human colon cancer cells NIVOLUMAB promotes survival and could protect tumor cells from conventional therapies. J Immunother Cancer, 2022. 10(3).