Let-7i-5p通过抑制肿瘤抑制性自噬促进鼻咽癌的恶性表型

miRNA调节基因表达，参与肿瘤的发生和发展。因此，识别与miRNA和治疗靶点相关的恶性表型将有助于改善鼻咽癌（NPC）的治疗。在这项研究中，我们证明let-7i-5p的过表达通过靶向NPC中的ATG10和ATG16L1从而促进恶性表型。根据对GEO和TCGA数据库的分析，let-7i-5p在鼻咽癌和头颈癌中的表达水平显著升高。通过对150例鼻咽癌组织的队列研究，我们发现let-7i-5p与晚期、复发、转移、淋巴结转移和不良临床结果相关。除了一系列体外细胞分析外，体内小鼠肿瘤模型显示let-7i-5p通过靶向ATG10和ATG16L1抑制自噬并促进NPC的恶性表型。我们的研究结果表明，let-7i-5p可能是鼻咽癌治疗的一个有希望的治疗靶点。本文于2022年1月发表于“Cancer Letters”（IF= 8.679）上。

技术路线

结果

1）Let-7i-5p在鼻咽癌组织中的表达水平升高，并与不良临床结果相关

为了评估NPC miRNA表达谱，使用GEO数据库（GSE70970）对246个肿瘤组织和17个非肿瘤组织的微阵列数据集进行分析。这些数据显示，33个miRNA的表达发生了显著改变。排名前1-17位的候选基因是EBV相关的miRNA，第18位是let-7i-5p，它在NPC组织中显著增加，引起了我们的注意（图1A）。TCGA数据库查询用于确认let-7i-5p在头颈癌中的表达增加（图1B和C）。为了评估let-7i-5p在鼻咽癌中的作用，我们使用鼻咽癌组织芯片进行了原位杂交并进行了分析。结果显示，let-7i-5p在终末期疾病患者中显著上调，包括临床IV期、复发、远处转移和淋巴结转移（图1D-G）。Kaplan–Meier分析显示，let-7i-5p高表达患者的总生存率（OS）和无进展生存率（DFS）低于let-7i-5p低表达患者（图1H和I）。这些结果表明let-7i-5p的过表达在NPC进展中作为癌基因发挥作用，并代表一个有价值的预后生物标志物。

2）Let-7i-5p在体外促进鼻咽癌的迁移和增殖

通过一系列细胞分析进一步探讨了let-7i-5p在鼻咽癌中的致癌作用。首先，使用qRT–PCR测定NPC细胞系和非癌鼻咽上皮细胞系NP69中的let-7i-5p水平。let-7i-5p在所有NPC细胞系中显著过表达（图2A）。因为CNE-2和5-8F细胞系的表达量最高，所以它们被用来研究let-7i-5p对鼻咽癌细胞的直接影响。在用let-7i-5p抑制剂转染后，测定干扰效率以确认生成具有低let-7i-5p表达的细胞（图2B和C）。然后使用伤口愈合试验、Transwell试验、菌落形成试验、EdU试验和流式细胞术来确定let-7i-5p对NPC细胞生长和迁移的影响。根据伤口愈合和Transwell分析，let-7i-5p下调抑制了细胞迁移（图2D-G）。此外，基于增殖特性实验，包括集落分析、EdU和流式细胞术，let-7i-5p敲除抑制NPC细胞的增殖能力（图2H-M）。这些发现表明let-7i-5p在体外调节鼻咽癌细胞的迁移和增殖。

3）干扰let-7i-5p表达抑制体内鼻咽癌的转移和增殖能力

为了确定let-7i-5p是否在体内促进鼻咽癌转移和生长，我们建立了小鼠肿瘤异种移植和肿瘤转移模型。在敲除let-7i-5p后，将细胞接种到裸鼠腋窝，以评估let-7i-5p对细胞生长的影响（图3A）。移植后21天，切除异种移植肿瘤并称重。let-7i-5p低表达的细胞增殖减少（图3B和C）。此后，我们使用小鼠肿瘤转移模型来评估NPC转移。通过尾静脉将具有let-7i-5p抑制或对照的细胞注射到裸鼠体内。在实验期间，通过每3天测量一次生物发光来监测转移。注射后45天，NC组的三只裸鼠出现肺转移，而let-7i-5p基因敲除组的小鼠没有出现转移（图3D和E）。肺组织的HE染色显示，let-7i-5p低表达的小鼠表现出减少的癌症病变（图3F）。综上所述，这些数据表明let-7i-5p可加速鼻咽癌的转移和生长。

4）Let-7i-5p抑制鼻咽癌细胞自噬活性

由于一些自噬相关的miRNA已被报道可加速恶性表型，我们研究了let-7i-5p是否调节NPC自噬活性。我们发现沉默let-7i-5p表达导致LC3聚集的显著诱导，表明自噬体形成增加（图4A-D）。然后使用串联单体mRFP-GFP标记的LC3来确定let-7i-5p在自噬通量中的作用。如图4E-F所示，let-7i-5p基因敲除后，黄色荧光自噬体和红色荧光自溶体的数量显著增加（图4E-F）。与单独使用氯喹（CQ）治疗相比，CQ和let-7i-5p敲除联合治疗导致黄色荧光自噬体进一步累积（图4E-F）。这些结果表明let-7i-5p能有效抑制鼻咽癌细胞自噬体的形成和自噬通量。此外，通过免疫印迹检测自噬标记物LC3-I、LC3-II、自噬底物p62和自噬相关基因ATG5。我们观察到，随着let-7i-5p基因敲除，ATG5和LC3-II表达增加，p62水平降低（图4G-J）。总的来说，这些结果表明let-7i-5p能有效抑制鼻咽癌细胞的自噬活性。

5）ATG10和ATG16L1是let-7i-5p的直接靶点

最近的研究表明，miRNA可以通过靶向自噬相关基因来调节自噬，从而影响恶性转化。因此，我们探索了let-7i-5p是否也通过靶向自噬相关基因来调节鼻咽癌细胞的自噬水平。使用生物信息学工具和两个miRNA数据库，740个基因被确定为let-7i-5p的潜在靶点（图5A）。为了进一步确定let-7i-5p调节自噬的靶基因，我们在对740个预测候选基因进行KEGG通路分析后，重点研究了自噬相关通路（图5B）。在12个自噬相关靶点中，自噬相关基因10（ATG10）和自噬相关基因16 L（ATG16L）因其在调节自噬中的直接作用而被选中。通过将目标基因（WT-3′UTR）的3′UTR或突变序列（mut-3′UTR）克隆到荧光素酶质粒中，使用荧光素酶报告基因分析验证了let-7i-5p与ATG10和ATG16L的3’-UTR之间的生物有效相互作用（图5C）。let-7i-5p、ATG10和ATG16L的潜在结合位点如图5D所示。此外，在let-7i-5p缺失的鼻咽癌细胞和异种移植瘤中，ATG10和ATG16L1表达水平显著升高(图5E-H)。在缺乏let-7i-5p的细胞中，ATG12（ATG12-ATG5-ATG16复合物的一部分）的表达增加，而在ATG8中未观察到明显变化（图5E-F）。由LC3表达确定的自噬活性证实了let-7i-5p对自噬的影响（图5G-H）。这些数据清楚地表明ATG10和ATG16L是let-7i-5p的直接目标。

6）ATG10和ATG16L1对于let-7i-5p促进恶性NPC表型至关重要

为了研究ATG10和ATG16L1是否逆转let-7i-5p诱导的NPC恶性表型，我们进行了体外和体内拯救实验。ATG10和/或ATG16L1的敲除消除了let-7i-5p抑制增加细胞迁移和增殖的能力（图6A-C）。此外，小鼠异种移植瘤实验结果显示，let-7i-5p抑制降低了鼻咽癌细胞的增殖；然而，这种效应在ATG10和ATG16L1抑制后降低（图6D-E），表明let-7i-5p促进恶性表型取决于其抑制ATG10和ATG16L1表达的能力（图6F-G）。这些结果表明let-7i-5p的促肿瘤作用需要自噬相关基因ATG10和ATG16L1。

结论：我们的研究揭示了let-7i-5p通过靶向ATG10和ATG16L1抑制自噬来促进恶性表型的机制。我们的数据表明，let-7i-5p水平在鼻咽癌晚期显著升高，有助于预测临床结果。我们的研究为基于let-7i-5p的鼻咽癌分子治疗策略的制定提供了潜在的临床应用和新的方向。

参考文献：

You B, Zhang P, Gu M, Yin H, Fan Y, Yao H, Pan S, Xie H, Cheng T, Liu H, You Y, Liu J. Let-7i-5p promotes a malignant phenotype in nasopharyngeal carcinoma via inhibiting tumor-suppressive autophagy. Cancer Lett. 2022 Jan 29;531:14-26. doi: 10.1016/j.canlet.2022.01.019.