SUMOylation抑制增强多发性骨髓瘤对地塞米松的敏感性

多发性骨髓瘤（MM）是一种浆细胞恶性肿瘤。地塞米松（Dex）是MM治疗中使用最广泛的治疗药物，但患者会产生Dex耐药性，从而导致疾病的进展，因此迫切需要研究Dex耐药的驱动机制，并开发新的试剂来解决这一问题。目前有研究认为SUMO化修饰是调节Dex抗性的潜在机制，而抑制SUMO化修饰可以增强MM对Dex定的敏感性。该研究发表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》，IF：11.161。

技术路线：

主要研究结果：

1. 在原发病人样本和细胞系中，抑制SUMOylation增强Dex抗MM的活性

作者前期通过数据库和文献得到MM浆细胞中较高的SUMO E1（UBA2）基因表达与更短的存活时间相关。随后观察到UBA2表达水平与Dex IC₅₀s呈显著正相关，提示UBA2表达与MM细胞Dex耐药相关（图1A）。

用TAK-981（一种新型的选择性SUMO E1酶小分子抑制剂）处理MM1S细胞，检测SUMOylated蛋白（图1B）。TAK-981以剂量依赖的方式抑制整体SUMOylation，并诱导凋亡标志物cleaved PARP。然后，测试TAK-981单药和Dex联合治疗对MM的影响。在从复发骨髓瘤患者分离的原发MM细胞中，TAK-981联合Dex治疗比单药治疗显著增强了对MM细胞的杀伤力 （图1C）。进一步的细胞毒性实验发现TAK-981与Dex在MM1S和MM1R细胞株中均有协同作用（图1D）。Dex对MM1R细胞的诱导凋亡和抑制增殖作用有限。相比之下，TAK-981在两种细胞系中诱导细胞凋亡并降低细胞活力，与Dex联用后效果进一步增强（图1E）。瞬时敲除SAE2、UBC9可显著提高MM1R细胞Dex敏感性（图1F）。稳定敲除SAE2、UBC9的细胞对Dex处理均表现出显著的反应，MM1R cells的IC₅₀s值均下降（图1G）。这些数据表明，SUMOylation与Dex抗性有关，抑制SUMOylation增强了Dex敏感性

图1在原发性多发性骨髓瘤细胞和MM细胞系中，抑制SUMOylation与Dex协同降低细胞活力

2. TAK-981在体内显示出抗MM活性

通过构建小鼠两种异种移植模型，发现与对照组相比，TAK-981治疗组小鼠骨髓瘤负担显著降低（图2A-B）。另外，与体外实验一致，Dex单独治疗不影响肿瘤生长，而TAK-981与Dex联合治疗时，能显著抑制肿瘤生长，进一步降低肿瘤负荷（图3C）。免疫组化染色分析表明Dex单独处理几乎没有诱导细胞凋亡，而TAK-981处理组明显诱导cleaved PARP表达，Dex联合处理后cleaved PARP表达水平更高（图2D）。结果表明，TAK-981具有较强的体内抗MM活性。

图2 TAK 981在体内抑制MM肿瘤生长并与Dex协同作用

3. 抑制SUMOylation通过下调miR-130b上调GR来提高Dex的敏感性

有报道称GR的表达是Dex反应的主要机制，并与MM患者较好的预后有关。研究发现GR表达与原代MM细胞Dex IC₅₀s值呈负相关 （图3A）。基于SUMOylation抑制增强了Dex的敏感性，进而评估抑制SUMOylation对GR表达的影响：在TAK-981治疗48小时后，剂量依赖性GR （NR3C1） mRNA上调（图3B）。据报道，通过靶向3’-UTR下调GR mRNA水平的miR-130b，在相同的原代MM细胞中，经TAK-981处理后显示出剂量依赖性降低（图3C）。在TAK-981处理的原代MM细胞中也诱导了GR蛋白水平（图3D）。在MM1S和H929细胞系中观察到类似的GR水平诱导和miR-130b降低（图3E和F）。TAK-981降低了MM1S和H929细胞中RRM2水平，并进一步协同降低Dex对RRM2的降低。相应的诱导凋亡标志物cleaved PARP（图3G），表明TAK-981对Dex细胞毒性的增强与GR regulated RRM2的抑制有关。SAE2水平较低（Sumoylization low）的患者GR抑制基因RRM2表达较低，GR激活基因RASD1水平较高。该分析支持了表明SUMO化抑制上调GR途径。

图3 TAK-981通过下调miR-130b上调原发性多发性骨髓瘤和细胞系中GR的表达

4. 抑制SUMOylation通过调控miR-551b和miR-25提高了MM对Dex的敏感性

miR-mimic转染后，过表达miR-551b和miR-25可促进MM细胞增殖并降低MM1S细胞的Dex敏感性，IC₅₀s增加约4倍（图4A-B）。miR抑制剂转染miR-551b和miR-25后，miR-551b和miR-25的下调抑制了MM1R细胞的生长并增强了Dex敏感性，IC₅₀s从875 μM下降到193和142 μM（图4C-D）。这些数据表明，miR-551b和miR-25的表达可能与MM对Dex的耐药有关。

由于PJA1和ZNF280C在MM细胞中没有大量表达，因此ZFP36成为miR-551b的唯一潜在靶点。ZFP36编码的tristtrprolin （TTP）是一种RNA结合蛋白，通过破坏Cyclin D1和E2F1 mRNA的稳定性在癌细胞增殖中发挥重要作用。通过转染miR-551b inhibitor下调miR-551b水平，导致TTP水平升高，Cyclin D1和E2F1水平下降（图4E）。ZFP36与miR-551b在初次MM样本中的表达呈负相关（图4F），进一步表明miR-551b调节ZFP36的水平。miR-25的下调显著提高了ULK1的水平。敲低miR-25导致p27水平升高，这与MM初发样本中p27 mRNA水平与miR-25呈负相关的观察结果一致（图4G-H）。

图4 MiR-551b和MiR-25水平对MM Dex敏感性的影响

       MM1R细胞的miR-551b和miR-25水平高于MM1S（图5A）。Dex处理降低了MM1S中这两种miRs的水平，但对MM1R没有影响，而TAK-981处理降低了MM1S和MM1R细胞系中这两种miRs的水平，并在与Dex联合时进一步降低（图5A）。通过siRNA瞬时转染，SAE2或UBC9的下调降低了MM1R中miR-551b和miR-25的水平（图5B）。另外，与细胞实验结果一致，TAK-981治疗组miR-551b和miR-25水平降低，并在MM1R异种移植瘤组织中联合Dex治疗后进一步降低（图5C）。用不同浓度的TAK-981、miR-551b和miR-25处理5个原始MM样本，其水平均呈剂量依赖性显著降低，表明SUMOylation对miR-551b和miR-25的调控并不局限于细胞系（图5D）。并且TAKU-981诱导miR-551b靶基因TTP表达，导致MM1R细胞Cyclin D1和E2F1降低，诱导miR-25靶基因ULK1和p27的表达（图5E）。RNA-seq的GSEA分析显示，TAKU-981影响细胞周期、凋亡和自噬基因集（图5F），提示可能是通过这些基因靶向microRNAs- miR-551b和miR-25水平来达到作用。SAE2水平低的患者（UBA2；UBA2low组）的ZFP36（miR-551b靶基因）和ULK1（miR-25靶基因）水平高于SAE2水平高的患者（UBA2；UBA2high组）（图5G）。该分析进一步支持了SUMOylation调控miR-551b, miR-25及其靶基因的表达。

图5抑制SUMOylation降低miR-551b和miR-25水平

5. 抑制SUMOylation通过c-Myc降低miR-551b、miR-25和miR-130b的表达

在MM1S细胞中，c-Myc诱导的miR-551b、miR-25和miR-130b的pri-miR水平的增加可通过添加TAK-981处理来抑制（图6A）。在MM1S细胞中siRNA转染c-Myc （siMyc）导致pri-miRs和成熟miR水平显著降低（图6B）。在Dex诱导的c-Myc敲低后，pri-miRs和成熟miRs下降（图6C）。TAK-981处理显著降低了MM1S和MM1R细胞中这些miRs启动子区域c-Myc结合的占用率（图6D），证明SUMOylation通过c-Myc结合到启动子区域来调节这些miRs的转录。Dex在MM1S细胞中对c-Myc的结合略有降低，而在MM1R细胞中对c-Myc的结合无影响，说明这些miRs参与了MM对Dex的敏感性。通过观察15例复发患者原发MM细胞中c-Myc和SAE2水平与miR-551b、miR-25和miR-130b的表达之间的显著正相关，qPCR进一步证实了miR-551b、miR-25和miR-130b对MM细胞c-Myc和SAE2的调控（图6E-F）。这些都表明，SUMOylation通过介导c-Myc调控miR-551b、miR-25和miR-130b的表达。

图6 c-Myc是miR-551b、miR-25和miR-130b的主要转录因子

6. 抑制SUMOylation降低了c-Myc水平

Dex降低了Dex敏感的MM1S细胞中的c-Myc蛋白，但对MM1R细胞没有影响。然而，TAK-981处理显示MM1S和MM1R细胞系中的c-Myc蛋白均减少，并且与Dex联合使用时导致进一步减少（图7A）。GSEA显示TAK-981处理抑制了MM1S和MM1R细胞中Myc靶基因集，TAK-981和Dex联合处理比单独处理Dex更能抑制Myc靶基因集（图7B）。并且TAK-981处理MM1R细胞后，c-Myc蛋白水平呈时间依赖性下降（图7C）。与对照相比，TAK-981处理后的骨髓瘤细胞中c-Myc下降更快（图7D），表明抑制SUMOylation通过增强c-Myc的降解而下调了c-Myc。另外，western blot结果显示，TAK-981处理后，SUMOylation的c-Myc明显减少（图7E）。这些结果证明了c-Myc可通过直接SUMOylation进行调控。

图7 抑制SUMOylation通过调节蛋白稳定性降低了c-Myc蛋白水平

结论

该研究发现，SUMOylation抑制通过增加GR，降低miR-551b和miR-25，提高了MM对Dex的敏感性。SUMO E1抑制剂TAK-981大大提高了MM细胞系、原代样本和小鼠异种移植模型对Dex的敏感性。TAK-981与Dex联用具有明显的体内外协同抗MM作用。