三张结果图发10.9分神刊，不服来辩！

谷氨酰胺酶(GLS)同工酶GLS1和GLS2催化谷氨酰胺分解的第一步。GLS1是Th17分化的必要条件，其抑制作用可抑制动物自身免疫性疾病，但GLS2的功能尚不清楚。本研究旨在探讨GLS2在CD4+ T细胞功能和系统性红斑狼疮(SLE)发病机制中的作用。本研究结果表明，GLS2通过支持抗氧化防御，在CD4+ T细胞产生IL-2中发挥关键作用，并提供了一种新的方法来纠正SLE中T细胞产生IL-2。本研究于2022年3月发表在《Arthritis Rheumatology》IF:10.995期刊上。

技术路线：

主要实验结果：

1、在CD4+ T细胞中GLS2通过表观遗传降低ROS水平并增加IL-2的产生

GLS2在多种癌症细胞系中被报道可降低ROS水平。为了评估GLS2是否降低CD4+T细胞中ROS水平，对naïve CD4+ T细胞加以CD3和CD28抗体刺激，并转染空白载体、GLS1和GLS2过表达载体。结果如图1A所示，过表达GLS2而不是GLS1可以显著降低细胞内ROS水平。高水平ROS会早知脂质过氧化最终导致线粒体紊乱。和预期一致，GLS2过表达减少了CD4+T细胞的脂质过氧化（图1B）。Mitotracker Deep red和Green staining组合染色结果显示CD4+T细胞中GLS2过表达降低了线粒体去极化的细胞组分（图1C）。

此前，有研究表明使用NAC处理，一种ROS清除剂和GSH前体，可显著减少T细胞中ROS水平并增加IL-2的产生，用其治疗SLE患者可抑制疾病相关指标。本研究发现，过表达GLS2而非GLS1显著增加了CD4+T细胞IL-2启动子的活性和细胞上清中IL-2的浓度（图1D-1E）。由于IL-2表达是由IL-2基因启动子的CpG-DNA甲基化控制，所以作者进一步评估了IL-2基因启动子的CpG-DNA甲基化。基于此前报道和序列的保守性，作者关注4个甲基化区域（图1F）。过表达GLS2而非GLS1，导致CpG-DNA甲基化位点CNS1，CNS2，CNS3而非CNS4显著下降（图1G）。

总之，这些结果证实过表达GLS2而不是GLS1，显著降低CD4+T细胞的ROS水平，脂质过氧化和线粒体异常，并增加IL-2的产生。

图1在CD4+ T细胞中GLS2降低ROS水平并增加IL-2的产生

2、PDZ 结构域结合基序是 GLS2 介导的 ROS 和 IL-2 调节的必要条件

为理解GLS2和GLS1的差别是如何存在的，作者关注于两种蛋白质的结构。GLS2和GLS1的主要氨基酸序列排列都比较相近，而最大的差别在于它们的C端和N端。与GLS1不同，GLS2的C端有一个PDZ结构域结合基序，它可以与含有PDZ结构域的蛋白质结合（图2A）。据此，作者推测，GLS2对IL-2和ROS的调控依赖于蛋白质-蛋白质相互作用通过PDZ结构域。为了这个目的，作者构建了GLS2过表达载体，但其中PDZ结构域结合基序被相应的GLS1序列取代（图2A）。有趣的是，突变PDZ结构域结合基序后导致GLS2对ROS水平、脂质过氧化、线粒体异常的降低作用和对IL-2启动子活性的回复作用均显著减弱（图2B-2E）。总之，这些结果表明PDZ 结构域结合基序是 GLS2 介导的 ROS 和 IL-2 调节的必要条件。

图2GLS2介导的IL-2和ROS调控需要PDZ结合结构域

3、GLS2 可降低来自狼疮易发小鼠和 SLE 患者的 CD4+ T 细胞的ROS 水平并恢复产生 IL-2

CD4+ T 细胞中 IL-2 产生不足和细胞质 ROS 水平升高是 SLE 发展的关键因素。如图3A和3B所示，与对照鼠和健康人中分理出的CD4+ T 细胞比较，SLE模型鼠和SLE患者中分离出的CD4+ T 细胞中GLS2蛋白表达水平显著下降。此外，有无CD3和CD28抗体刺激的小鼠和人CD4+ T细胞中GLS2的表达差异无统计学意义，表明GLS2在狼疮T细胞中下降不是由于激活T细胞的增加。接下来，作者转染GLS1和GLS2过表达载体至SLE模型鼠和SLE患者分离出的CD4+T细胞中。结果显示，过表达GLS2而非GLS1，显著降低CD4+T细胞ROS水平，并回复IL-2启动子活性（图3C-3F）。这些结果说明GLS2纠正SLE来源CD4+T细胞的ROS的异常并回复IL2产生至正常水平。

图3 GLS2恢复CD4+ T细胞中IL-2的产生并降低的ROS水平，这些细胞来自有红斑狼疮倾向的小鼠和SLE患者

参考文献：

Hisada Ryo., Yoshida Nobuya., Orite Seo Yeon K., Umeda Masataka., Burbano Catalina., Scherlinger Marc., Kono Michihito., Krishfield Suzanne., Tsokos George C.(2022). Glutaminase 2 Promotes Interleukin-2 Production in CD4 T cells by Supporting Antioxidant Defense. Arthritis Rheumatol, undefined(undefined), undefined. doi:10.1002/art.42112