m6A修饰增强circALG1的海绵吸附力促进结直肠癌的转移

栏目:最新研究动态 发布时间:2022-04-21
本研究证实m6A修饰circALG1可增强其结合miR-342-5p和能力进而促进结直肠癌的转移......


大量研究显示m6A修饰可以增强mRNAlncRNA结合miRNA的能力。但是其对circRNA结合miRNA的影响尚不清楚。本研究证实m6A修饰circALG1可增强其结合miR-342-5p和能力进而促进结直肠癌的转移。本研究于20223月发表在《Molecular CancerIF: 27.401期刊上。

 

技术路线:


主要实验结果:

1circALG1CRC中高表达

circRNA的芯片分析结果显示,和癌旁组织比较,有353circRNAsCRC组织中显著上调(图1A),54circRNAs相比于健康对照在CRC患者外周血中显著上调(图1B)。对两种方法获得的差异表达circRNAs取交集,鉴定到两个circRNAs,分别是circALG1circCOL6A3(图1C)。随后利用在线网站SRAMP预测这两个circRNA是否发生m6A修饰,结果发现都发生,但由于在CRC患者的组织和外周血中circALG1的整体表达水平高于circCOL6A3,所以作者选择了circALG1作为后续研究的重点。此外,使用GEO中的GSE126094数据集进行验证,发现circALG1CRC癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织(图1D)。为进一步确定circALG1在结直肠癌中的表达水平,收集了40对结直肠癌患者的癌旁组织、20例结直肠癌患者术前和术后1周的血液标本以及15例健康个体的外周血标本进行qRT-PCR检测。结果显示circALG1CRC癌组织和外周血中均显著高表达(图1E-1F)。有趣的是,circALG1的表达在CRC术后一周的患者外周血中显著下降(图1G)。ROC曲线显示circALG1在结直肠癌患者癌组织和癌旁组织、结直肠癌患者外周血及健康人群外周血、结直肠癌患者术前、术后外周血的表达水平均有较好的区分(图1H-1J)。

1 circRNA的表达谱揭示circALG1CRC中高表达

 

2CRC细胞中circALG1的特征

针对circALG1形成环的位点作者设计了一种聚合引物和一种发散引物。琼脂糖凝胶电泳结果表明,聚合引物在cDNAgDNA中均扩增出条带,而发散引物仅扩增出cDNA的条带,进一步的cDNA测序发现环状位点的存在(2A),表明circALG1是环状的。亲本基因ALG1 mRNA相比,circALG1表现出对RNase R消化的抗性(图2B)。放线菌素处理后,细胞中circALG1的降解速度明显慢于ALG1 mRNA的降解速度,表明circALG1是稳定的(图2C)。核质分离实验和FISH实验表明circALG1主要定位于细胞质(图2D-2E)。

2 CRC细胞中circALG1的表征

 

3circALG1在体内外促进CRC的转移

作者检测了5中细胞系中circALG1的表达,发现其表达在HCT116中的最低,在SW480中最高,所以候选选择这两个细胞进行实验。在HCT116中构建circALG1稳定过表达的细胞株,在SW480中构建circALG1稳定干扰的细胞株。结果显示过表达circALG1后细胞的迁移和侵袭水平显著增强,沉默circALG1表达则相反(图3A-3B)。同时,作者构建了ALG1过表达和敲除的对照细胞株,但结果显示无论是过表达还是干扰ALG1CRC细胞迁移和侵袭都无显著影响。表明线性ALG1不影响circALG1的功能。此外,在体内肿瘤转移模型中,过表达circALG1的小鼠显示出更多的肝和肺转移结节,沉默circALG1则相反(图3-3D)。这些结果说明circALG1CRC转移相关。

3 circALG1促进CRC的体内转移

 

4m5A修饰circALG1增强CRC细胞的侵袭和迁移能力

通过在线网站SRAMP,发现circALG1极有可能发生m6A修饰,此外,甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)检测中观察到circALG1的富集,这证实了circALG1确实经历了m6A修饰(图4A)。随后研究circALG1 m6A修饰水平对circALG1功能的影响,通过突变circALG1中两个最有可能的m6A修饰位点后,构建其野生型和突变型质粒(图4B)。用同样数量的野生型和突变型质粒转染circALG1稳定沉默的SW480细胞株。qRT-PCR分析显示,不同组circALG1表达水平无差异(图4C);当一个位点发生突变时,细胞内m6a修饰的circALG1水平降低,而当两个位点发生突变时,细胞内未观察到m6a修饰的circALG1水平(图4D)。功能实验表明,circALG1m6A位点突变降低了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力(图4E)。这些结果表明,circALG1 m6A修饰水平与CRC细胞的迁移和侵袭能力呈正相关。

4 m5A修饰的circALG1促进CRC细胞的转移

 

5circALG1通过miR-342-5p促进CRC细胞的侵袭和迁移

作者利用在线软件预测到5个可能和circALG1结合的miRNAs,利用双荧光素酶探究了他们与circALG1之间的结合关系,结果显示,只有miR-342-5p的荧光活性相比于对照组显著下降(图5A),提示circALG1miR-342-5p之间可能存在结合关系。如图5B所示,构建circALG1miR-342-5p结合位点突变的circALG1质粒和野生型质粒,检测荧光素酶活性,结果显示共转染circALG1野生型质粒和miR-342-5p mimics时,荧光素酶活性显著下降,而共转染circALG1野生型质粒和miR-342-5p inhibitor时,则增强荧光素酶活性(图5B)。此外,在circALG1突变组荧光素酶活性不因miR-342-5p改变。这些结果表明circALG1可特异性结合miR-342-5p。在circALG1RAP实验中,观察到miR-342-5p的显著富集(图5C)。功能性实验表明过表达miR-342-5p可以逆转circALG1过表达对CRC细胞迁移和侵袭的增强作用(图5D);抑制miR-342-5p则可以逆转circALG1沉默对CRC细胞迁移和侵袭的抑制作用。这些说明circALG1通过海绵吸附miR-342-5p促进CRC细胞的侵袭和迁移。

5 circALG1通过miR-342-5p促进CRC细胞的侵袭和迁移

 

6PGFcircALG1/miR-342-5p信号轴的下游靶基因

为了探究circALG1/miR-342-5p信号轴的下游靶基因,作者对沉默circALG1前和沉默后的SW480细胞进行RNA测序。总计获得76个差异表达基因,其中有7个与miR-342-5p的预测靶基因重叠(图6A)。通过UALCAN进一步分析发现只有PGF的表达在CRC肿瘤组织中显著上调,并与不良预后相关,并且在本实验的CRC临床样本中PGF也在CRC中显著上调(图6B-6D)。

相关性分析结果显示PGF的表达和miR-342-5p的表达负相关(图6E)。双荧光素酶实验也证实PGFmiR-342-5p之间的存在直接结合关系(图6F)。进一步研究发现PGF5株细胞系中的表达趋势和circALG1一致。因而在SW480中进行PGF沉默表达的功能缺失实验,在HCT116中进行PGF过表达的功能获得实验,结果和预期一致,PGF沉默抑制细胞的侵袭和迁移,过表达则相反(图6G-6H)。随后发现过表达PGF可以显著上调ERK的磷酸化水平并激活上皮间质转化相关基因的表达,沉默PGF的表达结果则相反(图6I)。

回复实验结果显示,PGF沉默逆转了因circALG1过表达或miR-342-5p抑制导致的HCT116细胞迁移和侵袭的增强;反过来PGF过表达同样可逆转因circALG1抑制或miR-342-5p过表达导致的HCT116细胞迁移和侵袭的减弱(图6J-6K)。在CRC临床样本中,同样可观察到PGF的高表达,以及上调的ERK磷酸化和激活的上皮间质转化基因的表达(图6L)。

综上所述,PGFcircALG1/miR-342-5p信号轴的下游靶基因。

6 PGFcircALG1/miR-342-5p信号轴的下游靶基因

 

7m6A修饰circALG1增强其结合miR-342-5p的能力

为研究m6A修饰对circALG1功能的影响,进行了circALG1RAP实验使用SW480细胞,在该细胞中提前转染了circALG1的野生型载体和m6A修饰位点突变的载体。结果显示,circALG1m6A修饰的减少减弱了其与miR-342-5p的结合(图7A)。随后构建类似的双荧光素酶质粒即circALG1m6A修饰位点突变或不突变的质粒。结果显示circALG1 m6A修饰位点的突变增强了miR-342-5p mimics组荧光素酶的表达,荧光强度增加,当两个m6A修饰位点都发生突变时,荧光强度最高,但在mimics NC组荧光素酶强度不受circALG1m6A修饰位点突变的影响(图7B)。这些结果表明,miR-342-5p mimic对含有m6A修饰位点突变序列的circALG1的萤火虫荧光素酶质粒表达的抑制作用减弱,提示circALG1miR-342-5p的结合受m6A修饰的调控。

然后研究了m6A修饰影响circALG1miR-342-5p结合的具体机制。文献表明,circRNA m6A修饰的功能往往需要m6A修饰相关蛋白的参与。对circALG1 RAP中拉下的蛋白进行MS检测,YTHDF1m6A修饰相关蛋白中富集最高;因此,初步选择该蛋白作为研究重点(图7C)。此外,我们在YTHDF1 RIP实验中检测到circALG1的富集(图7D)。当circALG1 m6A修饰位点发生突变时,YTHDF1RIP检测结果显示,富集的circALG1明显减少,这说明circALG1YTHDF1的结合依赖于m6A修饰(图7E)。进一步研究发现干扰YTHDF1的表达降低了circALG1miR-342-5p的结合能力(图7F),并降低了靶基因PGF的表达(图7G),该作用是通过YTHDF1特异性增强circALG1的稳定性实现的(图7H)。

作者还从m6A writer的角度研究了circALG1 m6A修饰后ceRNA功能的变化。circALG1 m6A基序为RACH (R = AGH = A, CU),它可以被METTL3读取,并催化腺苷酸的甲基化。作者设计了METTL3 siRNA进行相关功能缺失实验。结果显示METTL3的沉默降低了circALG1 m6A修饰的水平,削弱了对miR-342-5p的结合能力(图7I)。双荧光素酶实验结果显示,含有circALG1野生型质粒序列时,沉默METTL3削弱了miR-342-5p对荧光素酶活性的抑制作用,增强了荧光素酶强度。而在circALG1m6A修饰位点突变的质粒中,METTL3的沉默不影响荧光素酶活性(图7J)。这些结果说明circALG1 m6A修饰增强其结合miR-342-5p的能力。

 

7 m6A修饰circALG1增强其结合miR-342-5p的能力

 

8 实验猜想:CircALG1通过竞争性结合miR-342-5p,减轻miR-342-5pPGF mRNA表达的抑制作用,促进PGF表达,导致CRC侵袭增强

 

参考文献:

Lin, C., Ma, M., Zhang, Y. et al. The N6-methyladenosine modification of circALG1 promotes the metastasis of colorectal cancer mediated by the miR-342-5p/PGF signalling pathway. Mol Cancer 21, 80 (2022). https://doi.org/10.1186/s12943-022-01560-6