ESCCAL-1-食管鳞状细胞癌的细胞周期进展的调控因子

LncRNAs在人食管鳞状细胞癌(ESCC)的发生发展中发挥重要作用。我们之前的研究表明，下调LncRNA ESCCAL-1的表达可抑制ESCC细胞的生长，但其机制尚不清楚。在这项研究中，我们发现ESCCAL-1的过表达通过阻断泛素介导的Gal-1的降解来促进ESCC细胞增殖和细胞周期进展。ESCCAL-1在ESCC组织中明显上调，具有很好的诊断价值。ESCCAL-1的过表达增强了ESCC细胞的增殖和细胞周期的进展，而下调ESCCAL-1则产生相反的效果。在机制上，LncRNA ESCCAL-1直接与Gal-1结合，在不影响其mRNA水平的情况下正向调控其蛋白水平。Gal-1的上调促进ESCC细胞增殖和细胞周期的进展。下调Gal-1可减轻ESCCAL-1介导的细胞高增殖、NF-κB信号通路激活和ESCC细胞致瘤性的影响。因此，我们的研究结果为ESCCAL-1通过与Gal-1蛋白相互作用和稳定来促进ESCC肿瘤发生和细胞周期进展的机制提供了新的见解，提示了一个潜在的ESCC治疗靶点。本文于2022年3月发表于NPJ PRECISION ONCOLOGY（IF=8.254）上。

技术路线

结果

1）多个转录数据集显示ESCCAL-1过表达作为ESCC潜在的诊断性生物标志物

通过分析来自GEO的GSE120356和GSE53622的LncRNA表达数据，我们发现与匹配的正常组织相比，ESCCAL-1是ESCC中上调最显著的LncRNA之一(图1A)。此外，我们还分析了来自ESCC样本的4个独立的基因表达数据集，包括TCGA队列、GEPIA队列、GSE53624队列、GSE53625队列。与正常组织相比，ESCCAL-1在ESCC肿瘤中的表达持续增加(图1B-E)。我们通过qRT-PCR进一步验证了ESCC标本中ESCCAL-1的表达模式。与正常组织相比，ESCCAL-1在ESCC肿瘤组织中显著过表达(图1F)。此外，ESCCAL-1在ESCC细胞株中的表达也上调(图1G)。我们进一步分析了ESCCAL-1表达与ESCC患者临床特点的关系，发现ESCCAL-1高表达与肿瘤分化不良显著相关，与肿瘤晚期轻度相关。这些数据表明，ESCCAL-1的高表达是一种有潜力的诊断性ESCC的生物标志物。

2）ESCCAL-1过表达促进ESCC细胞增殖

为了阐明ESCCAL-1在维持ESCC细胞增殖中的致癌作用，我们在一个ESCCAL-1表达相对较低的KYSE150细胞株中异位表达了ESCCAL-1，在ESCCAL-1表达较高的EC9706和KYSE450细胞株中沉默了ESCCAL-1的表达，并进行了CCK-8实验，菌落形成实验和EdU染色。通过qRTPCR证实了基于慢病毒重组载体的ESCCAL-1过表达(OE-AL-1)和敲低表达的效率(图2A, B)。过表达ESCCAL-1可提高KYSE150细胞的活力(图2C)，而敲低ESCCAL-1可随着时间的推移降低EC9706和KYSE450细胞的活力。集落形成实验表明，过表达ESCCAL-1能增强体外ESCC细胞的克隆形成能力(图2F)，而下调ESCCAL-1则能减少集落形成(图2G)。此外，EdU实验显示，异位表达ESCCAL-1促进了KYSE150细胞DNA合成(图2H)，而下调ESCCAL-1则抑制了EC9706和KYSE450细胞DNA合成(图2I, J)。总的来说，体外功能获得和功能丧失试验都证明ESCCAL-1促进ESCC细胞增殖。

3）ESCCAL-1过表达促进ESCC细胞周期进展

我们检测了异位表达的ESCCAL-1对ESCC细胞周期进程的影响。流式细胞术分析显示，与对照相比，过表达ESCCAL-1可导致KYSE150表达ESCCAL-1的G0/G1期减少，G2/M期增加(图3A)，而ESCCAL1基因的敲低则导致相反的结果(图3B-D)。由于CCND1复合物和cyclin依赖性激酶抑制剂 CDKN1A和CDKN1B是控制细胞周期进展的关键调控因子，我们随后检测了它们在ESCC细胞中的蛋白水平。结果表明，与对照组相比，ESCCAL-1的高表达使CDK4和CCND1的蛋白质水平上调了2倍以上（图3E），而ESCCAL-1的敲除使其蛋白质水平降低了70%（图3F，G）。有趣的是，ESCCAL-1的过表达使CDKN1A的蛋白质水平降低了约40%，但没有降低CDKN1B（图3E），而ESCCAL-1的敲除使CDKN1A的蛋白质水平显著增加了至少2.5倍（图3F，G）。这些结果表明CDK4、CCND1和CDKN1A有助于ESCCAL-1介导的ESCC细胞周期进程。

4）LncRNA ESCCAL-1直接与Gal-1蛋白结合并积极调节其蛋白水平

通过在线工具RNAfold分析了MFE模式和质心模式下ESCCAL-1转录本的二级结构，二者均预测了Y形结构（图4A），表明ESCCAL-1具有蛋白质结合潜力。事实上，我们通过RNA蛋白质下拉分析和质谱分析确定了一组可能与ESCCAL-1发生物理相互作用的蛋白质。然后，我们选择覆盖可靠性最高的前3位ESCCAL-1结合蛋白HSP10、Gal-1和H2B进行RIP验证。Gal-1被确认为lncRNA-ESCCAL-1结合的底物蛋白，如图4B，C所示。为了研究Gal-1的表达模式，我们通过qRT PCR检测了收集的41对新鲜ESCC手术标本中的Gal-1转录，我们观察到肿瘤组织和正常组织中Gal-1的mRNA水平没有显著差异（图4D）。此外，在41例ESCC标本中，Gal-1的mRNA水平和ESCCAL-1的转录水平之间没有显著相关性（图4E）。然而，与正常组织相比，15例ESCC肿瘤组织中有12例的Gal-1蛋白水平明显上调（图4F）。在15例ESCC肿瘤组织中，Gal-1的蛋白水平与ESCCAL1的转录水平呈正相关（图4G）。 此外，我们还发现在ESCC细胞系中Gal-1的蛋白水平上调，并与ESCCAL-1的表达呈正相关(图4H, I)。此外，ESCCAL-1的过表达增加了ESCC细胞中Gal-1的蛋白水平，而ESCCAL-1的敲除降低了Gal1的蛋白水平（图4J）。这些结果表明，lncRNA-ESCCAL-1直接与Gal-1蛋白结合并积极调节其蛋白水平，Gal-1蛋白是ESCCAL-1的下游分子。

5）Gal-1是一种致癌蛋白，促进ESCC细胞增殖和细胞周期进展

为了研究Gal-1在ESCC细胞增殖中的生物学作用，我们进行了CCK-8实验和EdU染色。基于慢病毒重组载体的Gal-1过表达（OE-Gal-1）和敲除的效率通过western blot测定（图5A）。CCK-8试验和EdU染色结果均显示，Gal-1的过表达增加了KYSE150的细胞增殖（图5B，E），而Gal-1的敲除降低了KYSE450和EC9706的增殖能力（图5C，D，F，G）。随后，我们检测了Gal-1异位表达对ESCC细胞周期进程的影响。流式细胞术分析表明，Gal-1的过表达导致G0/G1期显著减少（图5H），而Gal-1的敲除增加了ESCC细胞周期的G0/G1期（图5I，J）。此外，western blot显示，与对照组相比，Gal-1的高表达使CDK4和CCND1的蛋白质水平上调至少2倍（图5K），而Gal-1的敲除使其蛋白质水平下调高达60%（图5K）。Gal-1的过表达降低了CDKN1A的蛋白水平（图5K），总的来说，Gal-1促进ESCC细胞增殖和细胞周期进展。

6）ESCCAL-1通过Gal-1促进ESCC细胞周期进程

考虑到ESCCAL-1直接与Gal-1蛋白结合，并且它们在调节ESCC细胞增殖和周期方面具有相似的生物学功能，我们假设ESCCAL-1通过与Gal-1的相互作用在ESCC中发挥致癌作用。为了验证这一假设，我们进行了拯救实验，并使用CCK-8试验和EdU染色测量了其生物学功能。Gal-1的缺失显著损害了OE-ESCCAL-1诱导的ESCC中的高细胞增殖（图6A，B）。同时，流式细胞术和western blot分析显示，ESCCAL-1过表达对细胞周期和细胞周期调节因子（CDK4、CCND1和CDKN1A）的影响至少部分被ESCC细胞中Gal-1的敲除所消除（图6C，D）。为了探索Gal-1介导的可能信号通路，我们使用在线工具STRING预测Gal-1的蛋白质互作网络。在这个网络中，作为与Gal-1蛋白最密切相关的信号分子之一，NF-κB引起了我们的注意，因为之前的许多研究已经阐明，NF-κB信号的异常激活与肿瘤进展有关，包括ESCC。Western blot显示，ESCCAL-1的过表达导致NF-κB的激活，当Gal-1同时被敲除时，该信号显著减少（图6E）。这些结果表明，ESCCAL-1可能通过Gal-1依赖的NF-κB激活促进ESCC细胞周期进程。

7）ESCCAL-1以Gal-1介导的方式促进ESCC肿瘤生长

为了进一步阐明ESCCAL-1-Gal-1相互作用在控制ESCC肿瘤发生中的作用，进行了裸鼠成瘤实验。结果显示，来源于ESCCAL-1过表达细胞的肿瘤生长速度更快，肿瘤大小更大，肿瘤重量更重（图7A-C）。然而，Gal-1的缺失显著削弱了ESCCAL-1过表达对ESCC肿瘤生长的促进作用（图7A-C）。然后通过IHC染色检测异种移植瘤中增殖标记物Ki-67的水平。结果显示，与对照组相比，ESCCAL-1过表达组中Ki-67阳性细胞的数量显著增加，这进一步表明ESCCAL-1过表达促进了ESCC细胞在体内的增殖（图7D）。但是，由ESCCAL-1过表达诱导的Ki-67阳性细胞的增加明显被Gal-1敲除所抵消（图7D）。接下来，我们再次进行了体内拯救实验，以确认ESCCAL-1/Gal-1轴在ESCC生长中的作用。如图7E所示，我们发现Gal-1的过表达促进了肿瘤生长，而Gal-1的敲除抑制了体内肿瘤生长，进一步表明Gal-1在ESCC中的致癌作用。此外，ESCCAL-1基因敲除可显著减轻OE-Gal-1引起的肿瘤促进作用，表明ESCCAL-1/Gal-1轴参与了ESCC的进展。总之，这些数据表明ESCCAL-1以Gal-1依赖的方式促进ESCC肿瘤生长。

8）ESCCAL-1通过阻断Smurf1介导的泛素化增强Gal-1蛋白的稳定性

鉴于ESCCAL-1直接与Gal-1蛋白相互作用，并与Gal-1蛋白水平呈正相关，而不影响Gal-1 mRNA水平，我们打算探索ESCCAL-1介导的Gal-1蛋白在ESCC细胞中增加的潜在机制。首先，我们发现在KYSE450和EC9706细胞中，当用CHX处理指定时间时，ESCCAL-1的敲除缩短了Gal-1蛋白的半衰期（图8A，B）。此外，蛋白酶体抑制剂MG132（图8C）至少部分消除了ESCCAL-1敲除诱导的Gal-1蛋白减少，这表明ESCCAL-1通过阻断其泛素化介导的降解来保护Gal-1蛋白。进一步IP结合western blot证实，在MG132存在的情况下，敲除ESCCAL-1可显著促进ESCC细胞中Gal-1的泛素化（图8D），表明ESCCAL-1通过泛素-蛋白酶体途径（UPP）防止Gal-1蛋白降解，从而稳定Gal-1蛋白。为了初步研究ESCCAL-1缺失通过UPP导致Gal-1降解的潜在机制，我们寻找可能介导Gal-1泛素化修饰的E3泛素连接酶。我们重点研究了两种候选分子Smurf1和CUL4A，以进行实验验证。进一步IP结合western blot显示，敲除ESCCAL-1可促进Smurf1与Gal-1蛋白的结合（图8E），这表明Gal-1蛋白是Smurf1的底物之一。此外，我们发现siRNA介导的Smurf1消融增加了ESCC细胞中Gal-1的蛋白水平（图8F）。这些数据表明，ESCCAL-1通过阻断Smurf1介导的泛素化来稳定Gal-1蛋白（图8G）。

结论：
   我们证明ESCCAL1的过表达通过调节细胞周期调节因子促进ESCC的进展。LncRNA ESCCAL-1与Gal-1蛋白发生物理相互作用，阻止E3泛素连接酶Smurf1和Gal-1蛋白复合物的形成，从而稳定Gal-1蛋白。这种lncRNA与蛋白质相互作用的新机制为ESCC提供了潜在的治疗策略。

参考文献：

Cui Y, Yan M, Wu W, Lv P, Wang J, Huo Y, Lou Y, Ma X, Chang J, Guan F, Cao W. ESCCAL-1 promotes cell-cycle progression by interacting with and stabilizing galectin-1 in esophageal squamous cell carcinoma. NPJ Precis Oncol. 2022 Mar 1;6(1):12. doi: 10.1038/s41698-022-00255-x.