环状RNA ACTN4通过招募YBX1启动FZD7转录，促进肝内胆管癌进展

肝内胆管癌（ICC）是一种恶性肿瘤，由于ICC具有高度的侵袭性，且缺乏有效的治疗手段，尤其是晚期患者，其预后极差。环状RNA （circRNAs）是一类新型非编码RNA ，异常表达的circRNA与癌症的进展有关，而circRNAs在ICC癌的发生和发展中的作用仍有待确定。目前，有研究旨在鉴定ICC中上调的circRNA，并阐明其在信号通路中的功能。该研究发表在《Journal of Hepatology》，IF：25.083。

技术路线：

主要研究结果：

1. CircACTN4在ICC组织中上调

通过组织芯片发现，与癌旁组织相比，ICC组织中有17个CircRNA显著上调（图1A-B），且circACTN4表达量最高。qRT-PCR证实CircACTN4在ICC组织中过表达，以及对RNase R治疗的耐药性（图1C, D）。qRT-PCR检测circACTN4在四种细胞系中的表达，之后分别在RBE和FRH0201细胞系中探究了circACTN4的过表达和沉默（图1E）。使用荧光原位杂交和亚细胞分离试验，在RBE和FRH0201细胞的细胞核和细胞质中观察到circACTN4转录本（图1F,G）。与circACTN4低表达相比，ICC中circACTN4高表达与较差的3年总生存率和较高的复发率相关 （图1H, I）。

图1 CircACTN4的鉴定及其与ICC预后的关系

2. CircACTN4在体外和体内促进ICC细胞的增殖和侵袭

过表达circACTN4促进RBE细胞的增殖、迁移和侵袭，并且促进血管生成，而在FRH0201细胞中干扰circACTN4，抑制其恶性活动（图2A-C）。在异种移植模型中，干扰circACTN4抑制肺转移和肿瘤生长，而过表达circACTN4促进肺转移和肿瘤生长（图2D-G）。

图2 CircACTN4在体外和体内促进ICC的增殖、迁移和侵袭

3. CircACTN4调控ICC细胞中FZD7的表达

RNA测序鉴定出过表达circACTN4的RBE细胞中有103个差异表达基因 （图3A, B）。 qRT-PCR证实了Hippo/Wnt-related genes这些基因在过表达circACTN4的RBE细胞中过表达（图3C, D）。Western blot显示FZD7、ID2、CCN2和AXIN2的蛋白水平也随着circACTN4过表达或敲低而改变（图3E）。由于Wnt/b-catenin通路的受体FZD7在Hippo和Wnt通路中均高于ICC细胞中的circACTN4过度表达。TCGA数据库揭示了FZD7在ICC组织中的表达水平明显高于非肿瘤组织（图3F）。这些结果通过组织样本的qRT-PCR和IHC进一步证实（图3G，H）。此外，在20个ICC组织中，circACTN4的表达与FZD7的表达呈正相关（图3I）。ChIRP分析显示circACTN4富集在FZD7启动子转录起始位点（TSS）1200到800 bp的区域（图3J）。同时circACTN4沉默后，H3K27Ac组蛋白活性修饰在同一位点的富集度降低，但circACTN4过度表达后增加（图3K，L）。这些结果表明circACTN4可以结合FZD7启动子并触发FZD7表达。

图3 CircACTN4上调ICC细胞中FZD7的表达

4. CircACTN4与YBX1相互作用

RNA-pull down和western blotting结果显示，生物素标记的circACTN4探针可以在FRH0201细胞裂解液中沉淀内源性YBX1（图4A），这进一步被RIP和RNA EMSA证实（图4B, C）。这些结果表明，circACTN4和YBX1之间存在相互作用。circACTN4的表达与YBX1的表达呈正相关（图4D）。此外，TCGA数据显示，YBX1在ICC组织中的表达明显高于非肿瘤组织（图4E），这在ICC组织样本中通过qRT-PCR和IHC验证 （图4F）。此外，circACTN4在RBE细胞中过表达和在FRH0201细胞中敲除均不影响YBX1 mRNA的表达（图4G）。这些结果提示circACTN4与YBX1相互作用，并在ICC进展过程中启动下游基因转录。

图4 CircACTN4与YBX1相互作用

5. CircACTN4招募YBX1共同激活FZD7的转录

ChIP-seq分析表明，FRH0201细胞中的YBX1结合区广泛分布于基因组中，其中24.88%是启动子（图5A，B）。YBX1结合区的基序分析显示它们的结合序列偏好不同（图5C）。通过重叠RNA-seq和ChIP-seq的结果，发现FZD7是ICC细胞中circACTN4和YBX1的靶点（图5D）。ChIP-qPCR显示，YBX1与FZD7启动子富集在同一位点（-400bp~-1600bp）（图5E）。此外，YBX1基因敲除抑制了H3K27Ac修饰在FRH0201细胞FZD7启动子上的富集（图5F）。为了进一步证实circACTN4和YBX1共同调控FZD7的转录，敲除circACTN4，发现FZD7启动子上YBX1的富集程度减少（图5G）。FZD7 mRNA和蛋白水平的变化也与YBX1过表达和敲低一致（图5H）。细胞功能实验表明，YBX1的恢复可以挽救FZD7敲低介导的FRH0201细胞生长、血管生成和转移的抑制（图5I-L）。这些结果提示circACTN4可能是YBX1介导的FZD7在ICC细胞中表达所必需的。

图5 CircACTN4招募YBX1共激活FZD7转录

6. CircACTN4通过吸附miR- 424-5p上调YAP1的表达

Circular RNA Interactome数据库预测，circACTN4可作为几种miRNA的海绵。通过重叠Starbase和Circbase的miRNA靶标预测结果，12个候选miRNA被预测为circACTN4和YAP1的靶标（图6A）。此外，在转染si-circACTN4的FRH0201细胞中，只有miR-424-5p表达上调（图6B），而在RNA-RIP实验中，circACTN4可以直接与miR- 424-5p结合（图6C）。转染miR-424-5p mimic可导致RBE细胞增殖、迁移和侵袭能力下降（图6D, E）。此外，在转染miR-424-5p mimic的RBE细胞中，YAP1 mRNA和蛋白水平显著降低，而miR-424-5p inhibitor的结果相反（图6F）。这些结果表明，circACTN4通过海绵作用miR- 424-5p调节YAP1的表达。荧光素酶报告基因检测显示，与对照组相比，共转染miR-424-5p mimic和野生型荧光素酶报告基因的HEK-293 T细胞的荧光素酶活性显著降低（图6G）。RIP实验还显示，与IgG组相比，argonaute 2组circACTN4和miR-424-5p的富集增加（图6H）。这些结果提示circACTN4可作为miR-424- 5p的海绵在ICC细胞中上调YAP1。

图6 CircACTN4通过海绵吸波miR-424-5p上调YAP1的表达

7. CircACTN4参与Wnt/Hippo信号通路

由于FZD7是Wnt信号通路受体，推测circACTN4可能通过促进FZD7转录参与了该通路的调控。B-catenin和p-GSK3b表达的变化与circACTN4过表达或敲低表达一致（图7A）。在过表达circACTN4的RBE细胞中，b-catenin的核定位显著增加，而在表达circACTN4的FRH0201细胞中，b-catenin的核定位降低（图7B）。TOP/FOP - flash报告实验显示，Wnt/b-catenin通路活性分别根据circACTN4过表达或敲低而显著增加或降低（图7C）。免疫荧光检测了circACTN4对b-catenin和YAP1蛋白细胞定位的影响（图7D）。结果表明，YAP1和b-catenin共定位于circACTN4过表达的RBE细胞中，circACTN4促进了YAP1和b-catenin的核积累。免疫共沉淀进一步证实了YAP1与b-catenin之间的相互作用增强（图7E）。这些结果表明，circACTN4增强了YAP1和b-catenin、Hippo和Wnt通路的相互作用，促进了它们在ICC中的激活。

图7 CircACTN4参与Wnt/Hippo信号通路

结论：

ICC中circACTN4的高表达通过招募YBX1启动FZD7转录促进肿瘤的发展和进展。此外，circACTN4作为miR-424-5p的分子海绵，上调YAP1的表达。此外，circACTN4在ICC肿瘤发生过程中充当Hippo/YAP和Wnt/b-catenin通路之间的交叉点。该研究有助于更好地理解ICC肿瘤的发生。

参考文献：

Circular RNA ACTN4 promotes intrahepatic cholangiocarcinoma progression by recruiting YBX1 to initiate FZD7 transcription