FSTL1促进肝纤维化

FSTL1被广泛认为是一种分泌糖蛋白，但其在肝纤维化过程中调节巨噬细胞相关炎症的作用尚未被证实。在此，我们的目标是描述巨噬细胞FSTL1在肝纤维化发展中的作用。人和小鼠纤维化肝脏巨噬细胞中FSTL1的表达均显著升高。骨髓特异性FSTL1缺失可有效减缓肝纤维化的进展。在FSTL1^{M- KO}小鼠中，肝纤维化过程中形成的微环境炎症反应相对较少。在体内和体外，FSTL1^{M- KO}巨噬细胞表现出M1极化抑制和NF-κB通路激活的抑制。此外，本研究还表明，FSTL1通过其FK结构域直接与PKM2结合。有趣的是，FSTL1促进PKM2磷酸化和核易位，减少PKM2泛素化以增强PKM2依赖的糖酵解，增加M1极化。PKM2的药理激活部分缓解了FSTL1介导的糖酵解和炎症反应。本文于2022年1月发表于Gut（IF=23.059）上。

技术路线

结果：

1）FSTL1在纤维化肝组织的巨噬细胞中表达增加

首先，我们的目标是研究FSTL1在纤维化肝脏样本中的表达特征。我们收集了51个人类肝脏样本，包括正常和纤维化的肝脏组织。与正常对照肝脏相比，FSTL1的mRNA和蛋白表达在纤维化肝脏中显著升高(图1A,B)。接下来，我们确定FSTL1的表达是否主要在肝巨噬细胞中升高。双免疫荧光染色显示，FSTL1主要表达于人纤维化肝脏中的巨噬细胞上(图1C)。通过重新分析一个已发布的数据集，我们发现FSTL1在HCV诱导或NASH诱导的肝纤维化中表达显著升高(图1D)。为了证实这些发现，我们在三种广泛认可的肝纤维化动物模型中探索了FSTL1的表达，即CCl4注射诱导、BDL诱导和MCD饮食诱导的肝纤维化。所有模型肝组织中FSTL1的表达均显著升高(图1E,F)。然后，我们从纤维化的小鼠肝脏中分离出肝巨噬细胞。一致地，从纤维化肝脏分离的巨噬细胞中FSTL1 mRNA表达水平显著升高(图1G)。双免疫荧光染色进一步显示FSTL1+CD68+巨噬细胞在纤维化肝脏中明显多于对照组(图1H)。综上所述，FSTL1在肝组织中表达显著增加，尤其是在纤维化肝的巨噬细胞中。

2）髓系FSTL1缺乏可减轻肝纤维化

为了检测FSTL1+巨噬细胞在肝纤维化中的功能，我们使用Cre-LoxP系统创建骨髓特异性FSTL1-deficient (FSTL1^M-KO)小鼠。然后用CCl4注射、BDL或MCD饮食诱导FSTL1^FL/FL和FSTL1^{M- KO}小鼠肝纤维化。图2A显示，Masson 's、Sirius Red和α-SMA染色显示，FSTL1^M-KO小鼠的肝纤维化明显低于FSTL1^FL/FL小鼠。此外，FSTL1^M-KO小鼠中血清丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶水平较低(图2B)。此外，FSTL^{M- KO}小鼠肝脏组织中TGF-β、TIMP- 1和I型胶原蛋白的表达明显低于同窝小鼠(图2C)。WB分析进一步表明，FSTL1缺失降低了纤维化肝组织中I型胶原、α-SMA和TIMP- 1的表达(图2 D)。我们的结果表明，髓系FSTL1缺乏可减轻小鼠的肝纤维化。

3）髓系FSTL1缺乏可减轻纤维化肝中的炎症和巨噬细胞/中性粒细胞招募

我们研究了FSTL1⁺巨噬细胞对纤维化肝组织局部炎症的影响。图3A显示FSTL1^M-KO小鼠的纤维化肝脏中TNF-α和IL-1β的表达低于对照组，IL-10的表达高于对照组。一致的是，FSTL1^M-KO小鼠血清中TNF-α和IL-1β的水平较低，而IL-10高于同窝小鼠(图3B)。此外，我们通过F4/80和CD11b(巨噬细胞标记物)和Ly6G(中性粒细胞标记物)染色评估纤维化肝组织中肝脏炎症细胞的积累。与FSTL1^FL/FL小鼠相比，髓系特异性FSTL1缺乏显著降低纤维化肝组织中的巨噬细胞和中性粒细胞浸润(图3C-E)。

4）髓系FSTL1缺乏可抑制纤维化肝脏中M1极化和NF-κB通路激活

如上所述，髓系特异性FSTL1缺失可减轻肝脏炎症，提示FSTL1可能促进M1极化。首先，我们分析了肝脏切片中M1巨噬细胞的定量，结果显示FSTL1^{M- KO}小鼠中观察到的iNOS+CD68+巨噬细胞比FSTL1^FL/FL小鼠中要少(图4A)。此外，在FSTL1^M-KO小鼠中，iNOS mRNA表达下调，而Arg1在纤维化肝脏中表达上调(图4B)。WB分析显示，与对照组相比，髓系FSTL1缺陷小鼠纤维化肝脏中iNOS和p-STAT1的表达减少，p-STAT6的表达增加(图4C)。TLR-4/ NF-κB通路在巨噬细胞介导的急性/慢性肝脏炎症中是一个特性良好的调控通路。在此，纤维化肝脏的免疫染色和WB分析也显示FSTL1^{M- KO}小鼠表现出TLR- 4/NF-κB通路激活的抑制(图4D,E)。

5）FSTL1直接与PKM2结合，增强PKM2在巨噬细胞中的稳定性

为了进一步研究巨噬细胞FSTL1在肝纤维化过程中的调节作用机制，我们采用免疫沉淀(IP)法和LC- MS/MS筛选法探索FSTL1与巨噬细胞中潜在蛋白的结合。我们特别感兴趣的是确定PKM2是否与巨噬细胞中的FSTL1直接相互作用(图5A,B)。结果显示FSTL1在巨噬细胞中与PKM2结合(图5C)。此外，共聚焦免疫荧光分析显示，FSTL1与PKM2在细胞质和细胞核中共定位(图5D)。接下来，我们分析了FSTL1- PKM2相互作用的关键域。根据之前报道的FSTL1和PKM2的结构特征，构建了编码4个带有HA标记的FSTL1截短片段和3个带有FLAG标记的PKM2截短片段的质粒，转染293 T细胞(图5E)。我们的数据显示FSTL1的FK结构域对PKM2的N-端或C-端相互作用至关重要(图5F)。环己酰亚胺追踪实验的结果表明，在FSTL1下调的细胞中，PKM2的半衰期较短，而在FSTL1过表达的细胞中，PKM2的半衰期比对照细胞长得多(图5G)。这些结果表明，FSTL1可能通过抑制蛋白酶体降解来调控PKM2的稳定性。值得注意的是，我们观察到在FSTL1^M-KO和FSTL1^o/e骨髓源性巨噬细胞(BMDMs)培养物中加入MG-132后，PKM2蛋白水平降低并伴有FSTL1下调的情况得到了恢复(图5H)。然后，利用体外泛素化实验，我们检测FSTL1是否参与泛素介导的PKM2降解。下调FSTL1可增加FSTL1^M-KO BMDMs中PKM2蛋白的泛素化水平。泛素介导的PKM2降解作用在FSTL1过表达的BMDMs中明显消失(图5I)。

6）FSTL1促进纤维化肝组织巨噬细胞中的PKM2磷酸化和核易位

为了探索PKM2在FSTL1介导的巨噬细胞促炎表型转换中的作用，我们首先检测了肝纤维化巨噬细胞中PKM2的表达是否发生改变。免疫荧光染色显示，与对照组相比，纤维化肝脏中有更多的FSTL1+巨噬细胞和PKM2+巨噬细胞(图6A)。然后，我们分析了PKM2和FSTL1在人肝脏标本细胞质和细胞核中的蛋白表达，显示PKM2和FSTL1在纤维化肝组织胞质和细胞核中的表达均显著增加(图6B)，免疫荧光染色也显示患者肝脏巨噬细胞中PKM2和FSTL1的核易位显著增加(图6A)。人类纤维化肝脏的结果与小鼠纤维化肝脏的结果相似。相反，与FSTL1^FL/FL小鼠相比，髓系FSTL1的破坏明显减少了PKM2+巨噬细胞，并阻碍了PKM2在肝巨噬细胞中的核导入(图6C)。图6D显示，与FSTL1^FL/FL对照相比，FSTL1缺失降低了细胞质中总PKM2和p-PKM2的表达，进而降低了细胞核中总PKM2的表达。总之，这些结果表明巨噬细胞FSTL1促进PKM2的核易位。

7）FSTL1缺失可减轻巨噬细胞的炎症反应、M1极化和糖酵解

我们进一步分析FSTL1在体外对巨噬细胞功能的调节作用。FSTL1^M-KO巨噬细胞TNF-α和IL-1β表达降低，IL-10表达增加(图7A,B)。与体内实验一致，LPS处理后，FSTL1缺失减弱了M1极化，并降低了BMDMs中TLR-4/NF-κB通路的激活(图7C-G)。接下来，我们探讨了FSTL1缺乏是否能减少体外PKM2的表达和核易位。在FSTL1^M-KO BMDMs中，PKM2的表达及其核易位减弱(图7C,D)。此外，我们发现，与FSTL1^FL/FL BMDMs相比，LPS刺激后FSTL1^{M- KO} BMDMs中的ECAR和乳酸显著降低(图7H,I)。我们使用糖酵解抑制剂 2-DG阻断葡萄糖供应，发现FSTL1^M-KO BMDMs中IL-1β和iNOS表达的下降受到抑制(图7J)。

8）PKM2激活物抑制FSTL1介导的巨噬细胞M1极化和糖酵解

为了进一步确定PKM2对FSTL1诱导的巨噬细胞极化和糖酵解的影响，用小分子PKM2激活剂DASA-58处理过表达FSTL1 (FSTL1^o/e)的BMDMs。DASA-58减轻FSTL1^o/e诱导的TNF-α和IL-1β，同时增加IL-10水平(图8A,B)。PKM2、iNOS和p65的免疫荧光染色显示，PKM2核易位抑制逆转了FSTL1诱导的巨噬细胞M1极化和NF-κB活化(图8C,D)。WB分析证实了BMDMs中PKM2、p- PKM2、iNOS、p-STAT1、p-STAT6、TLR-4、p-Ikk和p-p65的表达(图8E-G)。为了进一步验证PKM2在FSTL1介导的糖酵解中的作用，我们检测了ECAR和相对乳酸释放水平。FSTL1^o/e BMDMs中的ECAR和乳酸显著高于FSTL1^n/e BMDMs，而DASA-58有效地逆转了FSTL1^o/e诱导的糖酵解增加(图8H,I)。此外，FSTL1^o/e相关的促炎介质(IL- 1β和iNOS)被2-DG中和(图8J)。

结论：FSTL1通过与PKM2结合，促进PKM2磷酸化，抑制PKM2泛素化，从而促进M1极化、糖酵解和炎症反应。我们的发现为改善巨噬细胞介导的肝脏炎症和纤维化的新治疗方法提供了理论基础。

参考文献：
Rao J, Wang H, Ni M, Wang Z, Wang Z, Wei S, Liu M, Wang P, Qiu J, Zhang L, Wu C, Shen H, Wang X, Cheng F, Lu L. FSTL1 promotes liver fibrosis by reprogramming macrophage function through modulating the intracellular function of PKM2. Gut. 2022 Feb 9:gutjnl-2021-325150. doi: 10.1136/gutjnl-2021-325150.