靶向CD96可以通过增强子宫颈癌中CD8+ 肿瘤免疫浸润细胞的功能来克服对PD-1抑制剂的耐药性

宫颈癌（cervical cancer ，CC）是女性最常见的恶性肿瘤之一， PD-1及其配体PD-L1相互结合启动T细胞的程序性死亡，使肿瘤细胞获得免疫逃逸。派姆单抗(pembrolizumab)是PD-1和PD-L1 抑制剂，已被批准用于CC，但仍有大量患者表现出先天耐药性。免疫检查点抑制剂是免疫治疗新方式，使用免疫检查点抑制剂(immune checkpoint blockade ，ICB)联合治疗能克服耐药性，提高治疗效果。为了确定靶向哪些受体，并确定最佳的抗体组合，带来更好地治疗效果，作者对受体在免疫细胞和肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)亚群上表达进行了研究。这篇文章2022年2月发表于《Journal for Immuno Therapy of Cancer》，IF=11.367。

本文技术路线：

主要结果：

1.对PD-1阻断不敏感的CC患者表现出CD8+ til细胞CD96高表达

为建立抗PD-1治疗模型，从14例手术切除的宫颈癌肿瘤组织中分离出单细胞悬液，并派姆单抗或免疫球蛋白作为对照处理肿瘤悬液24小时（Fig1A）。与对照组相比，派姆单抗治疗后细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应和肿瘤细胞凋亡均有所增加，且增加1.5倍以上的标本被认为是敏感的。结果显示，在14例标本中有4例产生了有效的检查点抑制（Fig1B）。4个敏感和10个耐药的样本检查免疫检查点的表达情况，结果显示不敏感的宫颈癌样本的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞中Tim-3和CD96显著升高（Fig1C）。从耐药患者身上收集了原发手术肿瘤样本，利用免疫荧光实验技术，作者观察到耐药的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞中CD96广泛表达（阳性比率76.8%）（Fig1D）。为了确定CD96+ CD8+ T细胞丰度对宫颈癌的影响，通过TCGA数据库发现CD96+ CD8+ T与CD96- CD8+ T的比例越高，生存率越低（Fig 1E）。这些数据表明CD96+ CD8+ T细胞在CC肿瘤逃逸中起关键作用。

Fig1. CC患者CD8+ TIL上ir的表达与pembrolizumab应答的关系

2.  CD96在瘤内CD8+ 细胞中上调并与PD-1共表达

接下来，他们收集了15个瘤内组织样本（IT）、5个配对的PT（瘤外组织）和血液样本，进一步探索CD96在宫颈癌PD-1阻断中的作用。结果发现血液中CD8+ T细胞中PD-1和CD96的表达极低。与瘤外样本相比，瘤内样本CD8+ T细胞中CD96和PD-1的表达显著升高（Fig 2A）。流式细胞图显示，在瘤内和瘤周的组织中，表达CD96的CD8+ T细胞通常同时表达PD-1（Fig 2B）。对派姆单抗不敏感的患者中，同时表达PD-1和CD96的CD8+ TIL比仅表达CD96的CD8+ TIL更常见（Fig 2C）。虽然敏感患者CD8+肿瘤浸润淋巴细胞上CD96的表达低于不敏感患者，但CD96+ PD-1+ 细胞百分比是CD96- PD-1+细胞百分比的两倍。总的来说，来自CC患者的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞中CD96表达上调，并且大多数CD8+ TIL共表达CD96和PD-1。

Fig2. CD96和PD-1在CD8+TIL上的共表达

3. CD96+ PD-1+ CD8+ TIL 表现出终末耗竭效应表型

为了解CD96+ PD-1+ CD8+肿瘤浸润淋巴细胞的分化状态，接下来了检测癌组织中CD45RA和CCR7的表达。根据CD45RA和CCR7的表达水平，T细胞分为以下四类：初始T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T（Tem）细胞和终末分化效应记忆T（TEMRA）细胞。结果显示CD96+ PD-1+ CD8肿瘤浸润淋巴细胞中TEMRA含量最高（Fig 3A）。耗竭已成为癌症患者T细胞功能障碍的公认模式。他们进一步研究了TIM-3和PD-1在耗竭CD8+ TIL上的表达模式。双阴性的CD8+ TIL几乎不表达Tim-3；CD96或PD-1阳性的CD8+ TIL的Tim-3表达上调；CD96+ PD-1+ CD8+ TIL的Tim-3+细胞比例最高，提示CD96和/或PD-1阳性的CD8+ TIL具有耗竭的表型（Fig 3B）按CD96和PD-1划分的CD8+ TIL亚组中eome阳性细胞比例差异无统计学意义。CD96 或 PD-1 单阳性细胞表现出 TCF-1 的显著上调。相反，双阴性和双阳性细胞表达少量的TCF-1,表明CD96− PD-1+ CD8+ TIL表现出干细胞样的前体耗竭T细胞特征（Fig 3C）。此外，淋巴细胞脱颗粒标记物在单阳性和双阳性细胞上的表达显著降低（Fig3D）。三种效应细胞因子的细胞比例在双阴性 CD8+ 肿瘤浸润细胞中高表达，而IL-2+、IFN-γ+和TNF-α+细胞的百分比在CD96+和/或PD-1+ TIL中下降且相似（Fig 3E）。与双阴性细胞相比，CD96+ PD-1− 和CD96− PD-1+ CD8+ TIL的细胞溶解蛋白GZMB和PrF1的表达降低（Fig3F）。而CD96+ PD-1+ CD8+ TIL的PRF1表达低于单个阳性细胞，而GZMB表达显著高于单个阳性细胞。这些结果表明，CD96 PD-1双阳性的CD8+ TIL具有内在的终末耗竭效应表型。而CD96− PD-1+ CD8+ TIL具有更多的前体衰竭样表型。

           Fig3. CD96+ PD-1+ CD8+ TIL上的记忆、转录和功能分子的表征。

4. CD96阻断增强PD-1阻断体外释放CD8+TIL功能

接下来，他们通过检测CD8+ TIL的增殖、细胞因子的产生和脱颗粒来评估CD96阻断是否促进了CD8+ TIL的抗肿瘤反应。与单一阻断组相比，双重阻断组的IFN-γ+ CD8+ TIL数量显著增加（Fig 4B）。同样，双重阻断促进CD8+ 肿瘤浸润细胞的增殖，Ki67+ 细胞比例显著高于对照组和单一阻断组（Fig 4C）。PD-1和CD96联合阻断导致的细胞毒性标志物（CD107a、GZMB和PRF1）明显高于单独阻断（Fig 4D）。在PD-1和CD96阻断的24小时之后评估PD-1和CD96的表达。CD96阻断对CD8+ TIL中PD-1的表达无影响，提示靶向CD96后受体未受调节（Fig 4E）。相反，他们观察到在PD-1阻断后，大多数受试患者的CD8+ TIL中CD96表达明显上调。这些结果可能表明在阻断PD-1期间CD8+ TIL具有了PD-1抵抗的表型，并为PD-1和CD96联合阻断提供了理论依据。

Fig4. PD-1和CD96体外阻断治疗后CD8+TIL功能恢复

5. CC患者CD226/CD96/TIGIT信号通路平衡被打破

CD226、CD96和TIGIT共同形成了一个形成免疫应答的途径，其中CD96和TIGIT传递抑制信号，而CD226传递激活信号。作者推测这两条信号通路在宫颈癌患者中免疫平衡可能被破坏，从而达到只激活或抑制的作用。

首先分析三个因子在宫颈癌患者血液、肿瘤组织和瘤旁样本的CD8+ T细胞中的表达。在肿瘤中，CD96+和TIGIT+亚群的比例显著增加，而在CD8+ TILs中CD226+细胞亚群显著减少。表明CD226+ CD8+ T细胞在肿瘤微环境的影响下可能向CD96+和TIGIT+ CD8+ T细胞转变（Fig 5A）。接下来，他们评估了CD155的表达。在血液中，树突细胞和单核细胞中CD155细胞高表达。 瘤周细胞中CD155+细胞的比例较低，而肿瘤细胞中CD155+细胞的比例显著升高（Fig 5B）。 免疫组织化学和免疫荧光实验进一步证实CD155在瘤内组织中广泛表达，而在瘤周组织中低表达。在对αPD-1敏感和不敏感的肿瘤标本中比较显示，CD155表达在各组之间没有差异（Fig5 C、E和F）。总之，他们的发现显示CD8+ 肿瘤浸润细胞中，CD226/CD96/TIGIT信号通路的不平衡可能导致CD96在宫颈癌中发挥负免疫调节作用。

Fig5. CC患者CD226/CD96/TIGIT信号失衡

6.CD96阻断增强PD-1阻断联合治疗的治疗活性

接下来，作者以C57BL/6小鼠为模型，探讨CD96阻断对体内肿瘤进展的影响(Fig 6A)。发现每周注射两次CD96或αPD-1显著延缓肿瘤生长并延长荷瘤小鼠的存活。此外，与单一阻断相比，联合治疗效果更佳(Fig6 BC)。免疫组化证实了αCD96或αPD-1具有显著的抑瘤活性且当联合治疗时具有较好的协同作用(Fig 6D)。在小鼠模型中，我们观察到PD-1抑制剂治疗的小鼠CD8+肿瘤浸润淋巴细胞中CD96表达显著上调，但CD96阻滞剂或两种阻滞剂联合治疗的小鼠未见明显上调。此外，单独阻断PD-1和CD96不影响CD8+肿瘤浸润淋巴细胞中PD-1的水平，但双重阻断显著下调PD-1的表达。这些结果支持PD-1的临床靶向与CD96阻断具有协同效应(Fig 6E)。接下来在小鼠中研究了CD96和PD-1阻断对CD8+ 肿瘤浸润细胞功能的影响。分析了产生效应细胞因子或细胞溶解蛋白的CD8+ TIL的百分比。与体外模型实验结果一致，单独阻断后CD107a和PRF1的表达较对照组增加，双阻断治疗进一步增强刺激效应。∆INF-γ、GZMB和TNF-α在双阻断治疗后有升高的趋势，但差异无统计学意义（Fig 6F）。

Fig6. CD96和PD-1联合阻断可促进TC-1荷瘤C57BL/6小鼠的抗肿瘤免疫

对PD-1阻断不敏感的CC患者常表现为CD96表达增加。在瘤内CD8+ T细胞中CD96和PD-1大部分存在共表达。表型分析显示， PD-1或CD96单阳性细胞表现前体耗竭样表型，而PD-1和CD96共表达的CD8+TIL多表现为终末耗竭的效应表型。此外，CD8+ T细胞中CD96/TIGIT/CD226信号通路破坏。表明CD96在CD8+ T细胞功能和PD-1抵抗中起免疫调节作用。在临床模型中，CD96通过增强抗肿瘤CD8+ TIL功能来增强PD-1的阻断作用，为宫颈癌的治疗提供了理论基础。

参考文献：

Wang, Y., et al., Targeting CD96 overcomes PD-1 blockade resistance by enhancing CD8+ TIL function in cervical cancer. J Immunother Cancer, 2022. 10(3).