在KEAP1缺失的肺癌中，靶向CoQ-FSP1轴驱动铁死亡和辐射抗性

铁死亡是脂质过氧化引起的一种特殊的细胞死亡方式，在癌症治疗中，由于对特定癌症遗传背景下的铁死亡机制的不完全理解而受到阻碍。KEAP1在肺癌中经常发生突变或失活，而KEAP1突变型肺癌对包括放疗在内的大多数治疗方法均有难治性。在本研究中，作者探讨了铁死亡抑制蛋白1 (FSP1，也被称为AIFM2)在肺癌中的作用机制。本文于2022年4月发表于《Nature communications》, IF=12.121。

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本文主要内容：

1 KEAP1缺乏的肺癌细胞对不同诱导剂诱导的铁死亡有不同的影响

至少有3种不同类型的铁死亡诱导剂，第一类诱导剂主要为erastin；第二类诱导剂为RSL3 和ML162，是通过抑制SLC7A11和GPX4RSL3引起铁死亡；第三类诱导剂FIN56通过同时消耗GPX4蛋白和CoQ诱导铁死亡(Fig. 1a)。在H1299细胞（KEAP1野生型肺癌细胞）中，KEAP1缺失显著增加NRF2以及其的转录靶点SLC7A1138的水平(Fig 1b)，并使H1299细胞对erastin引起的铁死亡产生抗性(Fig 1c)。此外，在H1299细胞中敲除KEAP1后，GPX4水平显著降低(Fig 1b)。尽管GPX4在KEAP1缺失的H1299细胞中表达下降，但KEAP1缺失显著促进了对RSL3或ML162的抗铁死亡的能力(Fig 1d）。相比之下，在H1299细胞中KEAP1却并不影响铁死亡对FIN56的敏感性(Fig 1e，f)。脂质过氧化是铁死亡的一个标志。KEAP1的缺乏减弱了由erastin、RSL3或ML162引起的脂质过氧化，但对FIN56没有影响。

在KEAP1缺失的H1299细胞中，GPX4水平的降低并不能解释为什么这些细胞对RSL3具有耐药性(抑制GPX4);另一方面，KEAP1缺失细胞中SLC7A11水平的增加可能是这些细胞对RSL3耐药性增加的原因(Fig. 1b, d)。然而，作者发现在KEAP1敲除的H1299细胞中敲除SLC7A11对细胞中RSL3的铁死亡敏感性没有显著影响(Fig. 1i, j)。使用ML162进行了类似的观察（Fig 1k)，并通过脂质过氧化测定进一步证实了这一观察结果(Fig. 1l, m)，然而，在H1299细胞中敲低GPX4诱导了大量脂质过氧化和铁死亡，KEAP1敲低对应着GPX4缺失，没有表现出明显的脂质过氧化或者细胞死亡(Fig. 1n–q)。

Fig1 KEAP1在肺癌细胞中以不依赖SLC7A11/ gpx4的方式调控铁死亡

2. 在KEAP1缺失的肺癌细胞中，FSP1是2类和3类铁死亡诱导剂差异效应的基础

在KEAP1突变的肺腺癌中，发现12个过表达基因参与CoQ代谢过程，其中FSP1是上调最显著的（Fig 2a）。KEAP1的缺失导致H1299和H23细胞中FSP1的表达增加（Fig 2b）。进一步表明，降低KEAP1敲除的H1299细胞中FSP1的表达(达到与对照细胞相似的水平)可使KEAP1缺失的细胞对RSL3或ML162重新敏感(Fig 2c–e)。在H1299和H23细胞中，KEAP1缺失诱导的对RSL3或ML162的抗性在iFSP1处理下基本消除(Fig. 2f, g)。在H1299细胞中，KEAP1的缺失降低了CoQ/CoQH2比值，而将KEAP1 KO细胞中的FSP1水平恢复到到对照组的水平，也可以恢复CoQ/CoQH2比值(Fig. 2h)。重要的是，在CoQ合成阻断条件下，KEAP1缺陷诱导的肺癌细胞对RSL3或ML162的抗铁死亡能力被大量消除(Fig. 2i–l)。总之，这些结果都表明KEAP1缺失可上调FSP1水平，并且在KEAP1缺陷的肺癌细胞中，CoQ-FSP1信号轴在介导铁死亡对2类铁死亡诱导剂的抵抗中发挥重要作用。

Fig2 KEAP1通过FSP1调控铁死亡敏感性

3. KEAP1通过NRF2介导的转录调控FSP1

NRF2通常与抗氧化反应元素(AREs)结合在基因启动子区域。进一步分析FSP1启动子，发现在FSP1基因转录起始位点上游1kb范围内发现了两个AREs (Fig 3a)。Chip分析显示，在A549细胞中，NRF2结合在两个AREs上(Fig 3b, c)。同样，在H1299细胞中将KEAP1删除显著增加了NRF2与这些AREs的结合(Fig 3d, e)。NRF2诱导剂叔丁基对苯二酚(TBHQ)的处理提高了NRF2和FSP1的水平(Fig. 3f)。相应的，FSP1启动子-荧光素酶活性显著增强，这一活性可以通过任意一个ARE的突变而部分降低，而两个AREs的突变则几乎完全消除(Fig. 3g, h)。同样，KEAP1的缺失增加了FSP1启动子荧光素酶的活性，而这种增加被ARE突变所消除(Fig. 3i)。

作者进一步研究了NRF2与KEAP1调控FSP1和铁死亡的相关性。发现在KEAP1敲低的细胞中，消除NRF2可以抑制KEAP1缺陷诱导的FSP1启动子荧光素酶活性和FSP1的表达 (Fig. 3i, j）。重要的是，在KEAP1/NRF2双敲除的细胞中FSP1的重新表达(与KEAP1 KO细胞中相似的水平)恢复了这些细胞中的铁死亡抗性(Fig. 3k, l）。综上所述，这些数据表明FSP1是NRF2转录靶点，肺癌细胞中KEAP1缺失导致FSP1通过上调NRF2从而产生铁死亡抗性。

Fig3 KEAP1通过nrf2介导的转录调控FSP1

4. 在KEAP1缺乏的肺癌中，FSP1对肿瘤生长至关重要

通过TCGA数据分析，作者研究了FSP1与人类癌症的潜在相关性。发现FSP1在肺癌、肾透明细胞癌、肾乳头状细胞癌、肾癌、胃腺癌、肝癌终得表达量明显高于正常人 (Fig. 4a)。此外，在LUAD、KIRC和卵巢癌中，FSP1的高表达与较短的患者生存期相关 (Fig. 4b)。FSP1缺失显著抑制KEAP1 敲低的小树中肿瘤的生长(Fig. 4c, d)。在这些肿瘤样本中，脂质过氧化标记物4-HNE显示KEAP1缺失降低了脂质过氧化标记物4-HNE的表达，在KEAP1缺失的肿瘤中，这被FSP1的缺失所恢复(Fig. 4e, f)。总之，在H1299异种移植模型中，FSP1对于KEAP1失活诱导的肿瘤生长是必需的(但可能是不够的)，此外，FSP1可能通过抑制脂质过氧化和铁死亡促进KEAP1缺失的肺肿瘤生长。

Fig4 FSP1在KEAP1缺陷癌中促进肿瘤发生

5. 抑制FSP1通过诱导铁死亡使KEAP1缺陷的肺癌细胞对辐射敏感

作者发现，KEAP1的缺失显著促进了H1299细胞的抗辐射能力，并进一步表明，NRF2的缺失使KEAP1敲除的细胞对放疗重新敏感，而在KEAP1/NRF2双敲除的细胞中重新表达FSP1可恢复这些细胞的抗辐射能力(Fig. 5a）。

KEAP1缺失显著降低了放疗诱导的脂质过氧化和铁死亡标记基因PTGS2的表达;这种衰减在KEAP1敲除的细胞中通过NRF2的缺失而被消除，然后在KEAP1/NRF2双敲除的细胞中通过FSP1的重新表达得以恢复(Fig. 5b, c)。作者进一步研究了FSP1失活是否使KEAP1缺失或突变的肺癌细胞对铁死亡诱导剂敏感。作者发现，从基因上耗尽FSP1可使KEAP1敲除的 H1299细胞对化疗敏感（Fig. 5d），并将化疗诱导的KEAP1 敲低的细胞中脂质过氧化和PTGS2表达水平恢复到与对照细胞相似的水平(Fig. 5e, f)。同样，iFSP1处理产生了强大的放射增敏效应(Fig. 5g)，并促进了化疗诱导的KEAP1缺乏的H1299细胞中脂质过氧化(Fig. 5h)。在KEAP1突变型A549细胞中，FSP1的缺失也促进了放射增敏和rt诱导的脂质过氧化(Fig. 5i–k)。通过在几个KEAP1突变的肺癌细胞系中使用iFSP1获得了类似的结果(Fig. 5l–o).

Fig5 FSP1抑制通过诱导铁死亡使KEAP1缺陷的肺癌细胞对辐射敏感

6. 在KEAP1缺乏或突变的肺癌细胞或肿瘤中，抑制CoQ合成可以克服放射抗性

上述数据表明，FSP1是一个重要的治疗靶点，iFSP1是治疗KEAP1突变型癌症的一种放射增敏剂。然而，iFSP1不能用于体内治疗。由于FSP1与CoQ通过相同的途径抑制亚铁降解，作者进一步测试了抑制CoQ生物合成对KEAP1失活的肺癌细胞的放射敏感性是否有影响。结果发现,4-CBA治疗逆转了KEAP1缺失引起的放射耐药(Fig. 6a)，并在KEAP1 敲除 H1299细胞中恢复铁死亡诱导剂诱导的脂质过氧化(Fig. 6b)。4-CBA处理对KEAP1突变体A549和H460细胞具有类似的放射增敏作用(Fig. 6c, d)。这些结果进一步证实了在A549和H460细胞中COQ2的基因缺失(Fig  6e–g)。重要的是，4-CBA处理没有发挥放射增敏作用，也没有促进化疗诱导的人支气管上皮细胞(HBECs)的脂质过氧化（Fig 6h, i);因此，与正常肺上皮细胞相比，4-CBA在KEAP1敲低的肺癌细胞中似乎具有更强的促亚铁降解或放射增敏作用，提示4-CBA与化疗联合治疗存在药物治疗窗。

在A549异种移植瘤模型中，4-CBA治疗对肿瘤生长有中度抑制作用，4-CBA联合RT治疗对肿瘤生长有明显抑制作用(Fig. 6j, k），与这些肿瘤样本中4-HNE染色增加相关(Fig. 6l, m）。作者在具有KEAP1突变(TC494)的肺癌患者源性异种移植(PDXs)中进行了类似的观察(Fig. 6n–q)。总的来说，研究表明可以通过使用4-CBA来克服KEAP1失活肺癌的放射耐药。

Fig6抑制CoQ合成可逆转KEAP1缺失或突变的肺癌细胞或肿瘤的放射耐药

综上所述，通过了解在KEAP1缺陷的肺癌细胞中不同类型的诱导剂引起的铁死亡表型的机制，确定了CoQ-FSP1轴是一个关键的下游效应因子。在KEAP1缺乏的肺癌中，CoQ-FSP1轴作为KEAP1- nrf2通路的关键下游效应因子，介导ferroptosis和辐射抗性。作者进一步提出，利用CoQ-FSP1信号的药理靶向可以克服KEAP1缺陷引起的放射耐药，并治疗KEAP1突变型肺癌。因此，作者的研究确定了一种治疗这种致命疾病的潜在有效的治疗策略。

参考文献：

Koppula, P., et al., A targetable CoQ-FSP1 axis drives ferroptosis- and radiation-resistance in KEAP1 inactive lung cancers. Nat Commun, 2022. 13(1): p. 2206.