在胰管腺癌中，LncRNA-PACERR通过与miR-671-3p和m6A-reader IGF2BP2相互作用诱导肿瘤前巨噬细胞
胰腺导管腺癌（PDAC）是胰腺癌的主要类型，是最具侵袭性和致命性的消化道恶性肿瘤，预后极差。PDAC的严重预后与肿瘤微环境（TME）相关，其中组织相关的巨噬细胞（TAM）是PDAC TME中主要的免疫细胞。目前，有研究发现LncRNA-PACERR是PDAC TME中TAMs的关键调控因子，并揭示了其在细胞质和细胞核中的新机制。该研究于2022年5月7日发表在《Journal of Hematology & Oncology》，IF：17.388。
技术路线：
主要研究结果：
1. LncRNA-PACERR在TAMs中过表达，PACERR+ TAMs浸润升高与PDAC患者预后不良相关
为了确定PDAC中TAMs中LncRNA-PACERR的表达水平，使用磁激活细胞分选（MACS）从46名PDAC患者的癌旁组织中分离出CD163+细胞和CD80+细胞，这些巨噬细胞的体积为0.5 cm3。通过流式细胞仪分析确保了分选细胞的高纯度（图1b）。对肿瘤组织和非肿瘤组织组成的PDAC组织微阵列（TMAs）的FISH免疫荧光分析表明，LncRNA-PACERR在TAMs中的表达明显高于正常组织常驻巨噬细胞（M1-NTRMs） （图1c，d），并且CD163和LncRNA-PACERR之间存在很强的共定位关系（图1e）。Kaplan-Meier分析显示LncRNA-PACERR+ TAMs高浸润与PDAC预后不良相关 （图1f）。综上所述，这些结果表明LncRNA-PACERR+ TAMs越多，PDAC预后越差。
图1 TAMs中LncRNA-PACERR表达在PDAC组织中被激活，与预后不良相关
2. LncRNA-PACERR+ TAMs具有M2极化巨噬细胞的特征，在体外和体内均能促进胰腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭
为了明确PACERR的功能，利用THP-1细胞系和PATU-8988/PANC-1细胞构建TAMs体外共培养模型（图2a）。qPCR分析证实，TAMs敲除LncRNA-PACERR后，M2巨噬细胞标志物CD206、CD163、Arginase-1、TGF-β、IL-10、IL-6表达水平下调（图2a）。流式细胞术显示，THP-1来源的TAMs中LncRNA-PACERR表达减少，导致CD206+和CD163+巨噬细胞比例降低（图2b）。基于克隆形成和CCK8实验，TAMs中LncRNA-PACERR敲低可抑制胰腺癌细胞增殖（图2c）。Transwell实验表明TAMs中LncRNA-PACERR增加了胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力（图2d， e）。用两组小鼠来展示小鼠的预后，观察到LncRNA-PACERR敲低组小鼠的总生存期较阴性对照组小鼠更长（图3a-e）。对于转移小鼠模型，其皮下肿瘤模型和转移性肝细胞数量减少，CD163+细胞的数量和CD206 +细胞转移焦点在TAMs中LncRNA-PACERR敲除后降低（图3h-f）。
图2 LncRNA-PACERR的敲低在体外抑制THP -1衍生的TAMs的M2极化和促肿瘤功能
图3在体内LncRNA-PACERR+ TAMs促进PDAC细胞生长和肝转移
3. LncRNA-PACERR通过吸附miR-671-3p上调KLF12/p-AKT/c-myc轴
LncRNA-PACERR促进恶性肿瘤进展的分子机制：通过FISH和细胞分离实验确定了LncRNA-PACERR的亚细胞位置，揭示了LncRNA-PACERR在TAMs细胞质和细胞核中的主要分布（图4a-d）。qPCR检测了两个假定的LncRNA-PACERR靶标miRNA （miR-4448和miR-671-3p） （图4e）。在THP-1衍生的TAMs中，敲低LncRNA-PACERR后，miR-671-3p上调，而miR-4448未发生变化（图4e）。因此选择miR-671-3p进行进一步研究。作者发现LncRNA-PACERR对pri-miRNA或pre-miRNA的表达或启动子活性没有显著影响（图4f-h）。RIP结果显示，AGO2显著结合LncRNA-PACERR和miR-671-3p（图4i）。双荧光素酶报告基因检测确定了miR-671-3p与LncRNA-PACERR的相互作用（图4j，k）。此外，利用临床样本检测LncRNA-PACERR和miR-671-3p的表达，发现miR-671-3p在TAMs中的表达低于M1-NTRMs，并且与LncRNA-PACERR呈负相关（图4i， m）。为评估miR-671-3p的临床预后，对PDAC TMAs的患者进行分组，分为miR-671-3p+高组和miR-671-3p+低组（图4n）。Kaplan-Meier分析显示，miR-671-3p表达越高，PDAC的预后越好（图4n）。另外，作者对PDAC中报道过的最著名的靶基因KLF12，进行了确认（图5a）。qPCR分析和IF分析证实，KLF12在TAMs中高表达，与不良预后相关（图5b）。为了探究miR-671-3p是否可以直接海绵化KLF12，首先测定PDAC样本中miR-671-3p的RNA表达水平，发现KLF12与miR-671-3p之间存在负相关 （图5c）。此外，在THP-1衍生的TAMs中，转染miR-671-3p模拟物后KLF12 mRNA表达水平降低，转染miR-671-3p抑制剂后KLF12 mRNA表达水平升高（图5d）。双荧光素酶报告基因检测显示，用miR-671-3p模拟物转染HEK-293 T细胞后，Luc-KLF12-wt组的荧光素酶活性降低，而Luc-KLF12-mut组的荧光素酶活性没有变化（图5e， f）。此外，在TAMs中，KLF12的表达与LncRNA-PACERR的表达水平呈正相关（图5g）。转染miR-671-3p抑制剂后，LncRNA-PACERR敲低，可挽救THP-1中KLF12的表达（图5h， i）。转染LncRNA-PACERR过表达质粒增加了Luc-KLF12-wt的荧光素酶活性，转染LncRNA-PACERR和miR-671-3p模拟物减弱了HEK-293 T的这种作用（图5j）。western blot分析显示LncRNA-PACERR调控KLF12显著促进AKT磷酸化，通过下调THP-1衍生的TAMs中的PTEN增加c-myc的表达（图5k， l）。qPCR、流式细胞术、CCK8、集散形成和Transwell实验得到与LncRNA PACERR相似的结果，并且过表达KLF12可以促进LncRNA-PACERR的表达（图5m）。综上所述，LncRNA-PACERR可以通过隔离miR-671-3p来释放KLF12，从而通过KLF12/AKT/c-myc通路实现TAMs促进胰腺癌恶性进展。
图4 LncRNA-PACERR在TAMs中作为ceRNA海绵作用于miR-671-3p
图5 MiR-671-3p直接结合KLF12的3'UTR，调控KLF12/AKT/c-myc轴
4. KLF12/LncRNA-PACERR复合物通过招募EP300来促进LncRNA - PACERR在细胞核内的转录
根据图5m推测KLF12可能促进LncRNA-PACERR在细胞核内的转录。通过ChIP实验确定KLF12与TAMs中LncRNA-PACERR启动子区结合（图6a）。根据KLF12的motif预测了LncRNA-PACERR启动子区域的结合位点，发现KLF12结合在LncRNA-PACERR上游的-302—+ 100bp处（图6b-d）。鉴于大多数转录因子通过影响组蛋白修饰来调控基因转录，因此通过ChIP分析确定KLF12在TAMs中LncRNA-PACERR的TSS处增加了H3K27ac的富集（图6f）。因此，co-IP实验验证了KLF12会招募组蛋白乙酰转移酶EP300 （图6g）。RNA-pull down和RIP实验验证KLF12会与细胞核内的LncRNA-PACERR结合 （图6h， i）。综上所述，这些数据表明LncRNA-PACERR也直接受到KLF12的转录调控。
图6 KLF12直接与LncRNA-PACERR结合，并以LncRNA-PACERR依赖的方式将EP300招募到LncRNA-PACERR启动子区域
5. LncRNA-PACERR在TAMs中通过与IGF2BP2协同发挥致癌作用
首先通过RNA-pull down和质谱分析来筛选出于LncRNA-PACERR相互作用的m6a相关蛋白-IGF2BP2（图7a）。然后，进一步验证了IGF2BP2作为LncRNA-PACERR的RNA结合蛋白（图7b）。另外，RIP实验也证实了IGF2BP2与LncRNA-PACERR之间的关系（图7c）。此外，THP-1驱动的TAMs中LncRNA-PACERR FISH和IGF2BP2的共定位分析支持了它们的相互作用（图7d）。RNA pull-down和western blot分析确定LncRNA-PACERR的1-293nt区域与IGF2BP2相互作用（图7e， f）。最后，构建了含有标记截短和全长IGF2BP2的HEK-293 T细胞，并通过RIPqPCR检测发现，KH1和KH2结构域对LncRNA-PACERR的招募具有决定性作用（图7g，h）。而qPCR、western blot、FISH和IF检测，LncRNA-PACERR和IGF2BP2彼此的表达水平并不改变（图7d， j， k）。这些结果表明LncRNA-PACERR与IGF2BP2存在物理结合作用。
图7 TAMs中LncRNA-PACERR直接与IGF2BP2结合
6. LncRNA-PACERR通过与IGF2BP2协同提高KLF12和c-myc的mRNA稳定性
由于KLF12和c-myc作为LncRNA-PACERR的下游靶点，推测LncRNA-PACERR是否与IGF2BP2共同调控KLF12和c-myc的稳定性。为了证实这一假设，首先使用qPCR和western blot分析来阐明LncRNA-PACERR/IGF2BP2对KLF12和c-myc表达的正向调控作用（图8a，b）。放线菌素D发现，IGF2BP2敲除消除了LncRNA-PACERR过表达增加的KLF12和c-myc的稳定。LncRNA-PACERR敲除通过IGF2BP2过表达解除了KLF12和c-myc的半衰期（图8c-f）。为了进一步阐明KLF12和c-myc是否被m6A甲基化修饰，使用基于GGAC m6A核心基序的m6A RIP qRT-PCR分析表明，在甲基转移酶样14（METTL14）敲除THP-1细胞中，KLF12转录本3'UTR的m6A甲基化和c-myc转录本的编码区不稳定决定簇（CRD）区域降低（图8g）。为了探究LncRNA-PACERR是否影响IGF2BP2与KLF12和c-myc m6a修饰区域的结合，通过RIP-qPCR检测，LncRNA-PACERR敲低显著降低了IGF2BP2与KLF12和c-myc m6a修饰区域的结合（图8h， i）。鉴于IGF2BP2调节的m6A修饰区域主要位于mRNA 3'UTR的起始点，因此构建KLF12 3'UTR的荧光素酶报告载体，然后通过RIP-qPCR验证野生型报告基因中IGF2BP2和m6A比突变报告基因中富集（图8j-l）。此外，双荧光素酶报告分析显示，LncRNA-PACERR增加了KLF12-3'UTR野生型报告基因中的荧光素酶活性，与IGF2BP2的结果相似（图8m）。这些数据表明，LncRNA-PACERR与IGF2BP2合作，增强了KLF12和c-myc在TAMs中的稳定性。
图8 LncRNA-PACERR与IGF2BP2以m6a依赖的方式共同调控KLF12和c-myc
结论：
LncRNA-PACERR通过两个途径促进胰腺癌的恶性进展:作为ceRNA海绵体的miR-671-3p激活KLF12/ AKT/c-myc通路，并与IGF2BP2相互作用增强KLF12和c-myc的稳定性。同时，KLF12转录的LncRNA-PACERR与KLF12直接相互作用，KLF12/PACERR复合物通过招募EP300激活LncRNA-PACERR转录，从而促进TAMs中的M2极化和肿瘤前功能。