高分新思路：微生物-肠-心轴调控年龄相关房颤

年龄是房颤（AF）患者增加最重要的因素。肠道微生物异常参与年龄相关疾病。然而，肠道微生物异常是否参与年龄相关AF进展尚未可知。本研究描述了异常肠道菌群在年龄相关性房颤发病机制中的一种新的因果作用，即异常肠道菌群通过脂多糖（LPS）和葡萄糖（Glu）诱导激活NLRP3炎性小体诱导年龄相关AF。这表明微生物-肠道屏障-心房NLRP3炎症小体轴可能是治疗年龄相关性心律失常的一个合理的分子靶点。本研究于2022年2月发表在《Cardiovascular Research》IF：10.787期刊上。

技术路线：

主要研究结果

1、年龄改变了肠道菌群组成并促进AF易感性

为确定衰老是否影响大鼠对AF的易感性，分别对老年大鼠(22-24月龄)和幼龄大鼠(2-3月龄)进行心房电生理试验。与之前的临床研究结果一致，与幼龄鼠比较，老年大鼠更容易发生AF（附图2A-C）。随后表征了老年鼠和幼龄鼠的粪便微生物组。PCA分析显示微生物群落结构在PC1和PC2组分均被年龄显著分离（附图2D）。在门水平，随年龄老化，Spirochaetae增加而Verrucomicrobia减少（附图2E）。与此前研究类似，老年鼠与幼龄鼠的肠道中Firmicutes厚壁菌门与Bacteroidetes拟杆菌门的比例显著降低，F/B比例，是肠道微生物失衡的一个指标（附图2F）。这一发现支持了对AF易感性的增加与衰老过程中肠道失衡的发展密切相关的观点。在科水平，老年鼠乳杆菌属(Lactobacillus spp.)的丰度较高，而Bacteroidaceae家族成员的丰度在幼龄大鼠中明显低于老年大鼠（附图2G）。这种差异可以延伸到属水平和OUT水平的α-多样性（附图2H-I）。这在幼龄鼠和年老大鼠之间显示的差异模式，表明在衰老过程中肠道微生物群的组成发生了显著的变化。

附图2老化过程改变肠道菌群并促进AF易感性

2、老年鼠微生物组移植增加了幼龄鼠的AF易感性

为了探究肠道微生物组在年龄相关AF中的作用，将老年AF鼠（aged-FMT）或幼龄鼠自身（young-FMT）来源的粪便微生物组移植（FMT）到幼龄鼠，并岁移植6周后的aged-FMT 鼠和young-FMT鼠进行16S测序。PCA显示两组微生物组分离（图1A）。属水平前15个差异菌群表明受体大鼠肠道菌群已成功向衰老表型转变（图1B）。这种改变可以延伸到属水平和OUT水平的α-多样性（图1C）。此外，在门水平上，部分微生物群的变化被aged-FMT 鼠移植给受体鼠（附图3A）。F/B比例在aged-FMT 鼠也显著下降（附图3B）。这些结果表明年龄相关FMT成功改变了幼龄鼠的肠道微生物生态。此外，aged-FMT 鼠和young-FMT鼠的体重无差别（附图3C）。

和预期相符，脉冲起搏可诱导aged-FMT 鼠的AF，但没能引起young-FMT的AF（图1D，附图3D）。与young-FMT鼠比较，aged-FMT 鼠有显著更高的诱导性（图1E）和更长的AF持续时间（图1F），但是两者间的AERP无差异（附图3E）。此外，Masson染色显示aged-FMT 鼠心房纤维化明显增加（图1G），心房中纤维化标志物TGF-β1和α-SMA的表达水平明显升高（附图3F）。而心室纤维化在二组间无差异（附图3G and 3H）。综上所述，这些数据表明，年龄相关的微生物失衡导致房颤的易感性增加。

图1老年鼠肠道微生物组在受体鼠成功重定植并促进其AF易感性

附图3老年鼠肠道微生物组在受体鼠成功重定植并促进其AF易感性

3、微生物来源LPS的增加随着老化促进AF

肠道微生物可通过产生活性代谢产物如氧化三甲胺、脂多糖、胆汁酸等来影响宿主生理机能。许多研究表明，循环LPS水平随着年龄的增长而升高，并在年龄相关疾病的炎症过程中发挥重要作用。因此，作者推测在衰老过程中LPS可能通过介导心房炎症促进AF。为了确定LPS在年龄相关AF中的作用，作者收集了1152份人类供体血浆样本进行LPS水平检测。结果发现，随着年龄的增长，人类供体的血浆LPS浓度逐渐增加（图2A）。此外，在aged-FMT 鼠中也发现循环LPS水平升高（图2B）。表明LPS可能介导了年龄相关AF的炎症反应。将LPS拮抗剂LPS-RS用于aged-FMT 鼠，发现aged-FMT 鼠的房颤诱发率和房颤持续时间，纤维化显著降低（图2C-F）。表明LPS介导年龄相关AF。

图2微生物来源LPS的增加随着老化促进AF

4、老年微生物组移植诱导肠道屏障功能异常

LPS是由革兰氏阴性菌的外膜囊泡产生，但是本研究中aged-FMT 鼠和young-FMT鼠的粪便中革兰氏阴性菌的丰度和LPS水平并无差异，提示衰老表型的循环LPS升高可能与肠道屏障功能障碍有关。因此，作者研究了aged-FMT是否改变了受体鼠肠道屏障的完整性。HE和Masson染色显示aged-FMT组的结肠近端绒毛长度较短，纤维化面积增加（图3A-C）。然后，我们用口服FITC检测肠通透性，现aged-FMT鼠血清FITC水平显著高于young-FMT鼠（图3D），提示肠道通透性改变。

为了揭示所观察到的肠道表型中微生物-上皮间相互作用的机制，作者深入分析了近端结肠组织样本的蛋白质组。与aged-FMT组相比，在young-FMT组的近端结肠组织样本中，共发现179个 (124个上调，55个下调)显著异常表达蛋白（图3E和3F）。KEGG分析显示这些差异蛋白富集至33个通路，主要是炎症相关通路（图3G）。这些结果表明，与循环LPS升高相关的炎症过程可能参与了增加肠道的通透性，并可通过年龄相关的微生物移植进行功能转移。

图3老年微生物组抑制诱导肠道屏障功能异常和病理

5、年龄相关LPS促进房颤通过激活心房NLRP3炎性小体

近来研究报道LPS诱导激活TLR4可作为NLRP3炎性小体的启动信号。为了探究NLRP3炎性小体是否是年龄相关微生物异常诱导AF的关键机制，作者检测了aged-FMT和young-FMT鼠的NLRP3炎性小体的激活情况。结果显示凋亡相关蛋白ASC的蛋白表达无变化，而NLRP3，pro-caspase-1，activated caspase-1则在aged-FMT鼠中显著增加（图4A）。为验证NLRP3炎症小体对老龄相关微生物失衡引起的AF的刺激作用，给aged-FMT鼠使用选择性炎症小体抑制剂MCC950来中断NLRP3-炎症小体复合物的组装。结果显示，与对照组比较，猝发起搏引起的aged-FMT鼠的AF作用被MCC950显著抑制，且MCC950还能抑制AF的诱导率和AF持续时间（图4B-4D），还发现aged-FMT+MCC950组鼠表现出更少的心房胶原沉积和胶原体积组分（图4E）。这些数据表明老年大鼠微生物组诱导的NLRP3增强会导致循环LPS增加最终由于心房纤维化导致AF。

图4年龄失衡通过激活NLRP3通路促进AF易感性

6、过量葡萄糖协同LPS增强NLRP3炎性小体活性

NLRP3 炎性体可以响应于结构多样的损伤相关分子模式而被激活，例如随着衰老而增加的过量葡萄糖。由于LPS需要其他物质来激活NLRP3炎症小体，作者推测葡萄糖可能参与了年龄相关性AF的发展。在本研究中，作者发现老年大鼠2 h口服糖耐量试验(OGTT)的结果明显高于幼年大鼠，糖耐量受损可通过FMT传递（图5A和5B），提示老年微生物群失调导致糖耐量受损。

在体外，使用LPS和高糖处理原代大鼠心肌细胞（CMs）和心肌成纤维细胞（CFs）模拟老年房颤患者的病理内环境。有趣的是，单独的 LPS 和 HG 都不能激活 CF 中的 NLRP3 炎症小体，只有在LPS 和 HG 一起孵育时，才能激活 NLRP3 炎症小体（图5C和5D）。然而，LPS和高糖处理CMs对NLRP3炎性小体的表达毫无影响（图5E和5F）。总之，这些结果表明，高糖是LPS激活心房NLRP3 -炎症的必要条件，而CF中的TLR4易受LPS和高糖的影响，这可以解释心房纤维化随衰老而增强的原因。

图5 LPS和高葡萄糖可以增强激活NLRP3炎性小体

7、长期健康的幼龄微生物组抑制可抑制老龄大鼠的AF

鉴于 LPS 需要过量的葡萄糖以 TLR4 方式增强 CFs 中 NLRP3 炎症小体的活性，作者通过使用健康的幼龄微生物群干预，评估微生物群重定殖对老年相关 AF 的潜在治疗作用。结果发现接受young+FMT的处理老年鼠比接受aged+FMT处理的老年鼠有更长的结肠近端绒毛（图6A and 6B），和更少的纤维化区域（图6A and 6C）。随后发现上调的血浆LPS（图6D）在young+FMT受体鼠中均得到恢复。有趣的是，young-FMT显著降低心房NLRP3 -炎性小体的激活（图6E）。心房纤维化（图6F）。此外重定植young+FMT的老年大鼠在诱导AF时失败了（图6G-H）。表明长期的young+FMT可以阻止年龄相关的AF通过抑制心房NLRP3炎症小体活性。

图6幼龄鼠来源FMT可以抑制AF易感性通过抑制NLRP3炎性小体通路和重塑肠道屏障功能

8、老年临床患者微生物代谢产物和心房的病理变化

在发现肠道菌群与老年相关性房颤之间的潜在关系后，进一步在临床个体中证实这一数据。结果表明，无论是与年轻患者还是与年老患者比较，老年AF患者心房样本中的NLRP3，pro-caspase-1和activated caspase-1的水平均显著升高（图7A）。为进一步研究循环LPS水平与AF患者年龄之间的增量值，据按年龄四分位数分层的 LPS 检查了临床个体中 AF 的患病率(图7B)。随着LPS水平的升高，中老年房颤的患病率呈上升趋势，但在年轻组不明显。接下来，收集12012个符合条件的临床个体的OGTT结果，其中2298人被诊断为2型糖尿病。发现，响应 OGTT 的血浆葡萄糖水平随着年龄的增长而连续上升，直到在 81-90 岁时达到峰值(图7C)。此外，随着年龄的增长，血糖峰值出现了延迟，表明衰老延长了葡萄糖负荷时间。此外，响应OGTT的2hG水平也随着年龄增长而逐渐增加(图7D)。总之，这些结果阐明了肠道菌群在老年相关性心房纤颤中的作用，并为针对老年相关性心血管疾病的肠道菌群治疗策略提供了更多的证据。

图7 临床患者心房及循环LPS和Glu的病理变化

总之，如图8，与年龄相关的肠道菌群失调的后果用蓝色箭头表示：失调导致紧密连接蛋白（包括 ZO-1、claudin-4）的表达水平降低，并在肠道中闭塞，从而导致肠道通透性增加 并导致 LPS 转移到循环中并可能导致葡萄糖耐量受损。 LPS和过量葡萄糖增强心房NLRP3-炎症小体活性，导致心房结构因纤维化而重塑。

图8老年菌群失调导致AF促进的机制模式图

参考文献：

Zhang Yun., Zhang Song., Li Bolin., Luo Yingchun., Gong Yongtai., Jin Xuexin., Zhang Jiawei., Zhou Yun., Zhuo Xiaozhen., Wang Zixi., Zhao Xinbo., Han Xuejie., Gao Yunlong., Yu Hui., Liang Desen., Zhao Shiqi., Sun Danghui., Wang Dingyu., Xu Wei., Qu Guangjin., Bo Wanlan., Li Dan., Wu Yue., Li Yue.(2022). Gut microbiota dysbiosis promotes age-related atrial fibrillation by lipopolysaccharide and glucose-induced activation of NLRP3-inflammasome. Cardiovasc Res, 118(3), 785-797. doi:10.1093/cvr/cvab114