设计巧妙的实验思路，一起来发高分吧！- NCAPD3通过c-myc和E2F1增强Warburg效应，促进大肠癌的发生发展

NCAPD3是凝聚蛋白II复合物的三个非SMC亚基之一，在有丝分裂过程中对染色体的凝聚和分离起着重要作用。值得注意的是，在许多体细胞癌症中发现NCAPD3水平升高。然而，NCAPD3在癌症尤其是结直肠癌中的临床作用、生物学功能和潜在的分子机制仍不清楚。目前，有研究发现NCAPD3在结直肠癌发生和结直肠癌进展中促进糖代谢重编程并增强Warburg效应，该文章发表在《JOURNAL OF EXPERIMENTAL & CLINICAL CANCER RESEARCH》，IF: 11.161。

技术路线：

主要研究结果：

1. NCAPD3在CRC细胞和临床标本中过表达

对人类CRC组织及其对应的正常组织进行RNA-seq分析，数据分析显示，与正常组织相比，肿瘤组织中NCAPD3的表达明显升高（图1A）。与正常组织相比，NCAPD3在肿瘤组织中显著过表达（图1B, C）。此外，Western blot检测显示，与人类正常结肠黏膜细胞系FHC相比，CRC细胞系中NCAPD3的蛋白水平显著增加（图1D上图）。在临床标本中，通过qRTPCR、Western blot和免疫化学分析，CRC组织中NCAPD3 mRNA和蛋白水平也明显高于正常组织（图1D下图，1E, 1F）。这些结果表明，NCAPD3在CRC中过表达，提示NCAPD3与CRC关系密切。

图1 NCAPD3在人CRC中表达较高

2. NCAPD3增强CRC细胞的糖代谢重编程

在之前的一项研究中，从HT-29（结肠上皮腺癌细胞）中免疫沉淀NCAPD3，并用液相色谱-质谱分析共沉淀蛋白。通过KOBAS在线平台对文中发表的假定的NCAPD3相互作用体进行了功能富集分析，揭示了NCAPD3相互作用体在糖酵解和TCA循环中发挥作用（图2A）。与阴性对照相比，HCT116细胞中NCAPD3过表达显著增加了丙酮酸/乳酸/ATP的产生水平、乳酸脱氢酶的活性和2-NBDG的摄取，但降低了丙酮酸脱氢酶的活性，而在NCAPD3敲低的SW480细胞中，这一结果显著逆转（图2B-G）。此外，NCAPD3过表达可上调GLUT1、HK2、ENO1、PKM2和LDHA蛋白水平，但不上调PGK1和PGAM1蛋白水平。相比之下，NCAPD3敲除PGK1和PGAM1外，降低了这些糖酵解基因的表达（图2H）。如图2I所示，NCAPD3敲低显著降低了PDK1、PDK3和p-PDHE1α的表达水平，在NCAPD3过表达的细胞中得到了相反的结果，而PDHE1α的总蛋白水平保持不变。这些结果表明，NCAPD3增强了CRC细胞的有氧糖酵解，并减少了葡萄糖衍生碳到TCA循环的通量。

图2 NCAPD3增强CRC细胞的糖代谢重编程

3. NCAPD3通过调控CRC细胞中的c-Myc及其下游代谢相关基因促进有氧糖酵解

为了确定c-Myc参与了NCAPD3调控的有氧糖酵解，首先分析了临床标本的RNA-Seq数据。通过分析，发现CRC组织中的转录因子c-Myc水平明显高于正常结直肠组织（图3A）。如图3B所示，过表达NCAPD3的HCT116细胞中c-Myc的蛋白和mRNA水平显著升高，而敲低NCAPD3的SW480细胞中这一变化逆转。为了验证c-Myc对NCAPD3的糖酵解促进作用是必要的，在NCAPD3稳定过表达的HCT116细胞中使用siRNA和c-Myc抑制剂。数据显示，c-Myc敲低和10058-F4 （c-Myc抑制剂）处理可逆转NCAPD3诱导的GLUT1、HK2、ENO1、PKM2和LDHA的高表达 （图3C）。丙酮酸、乳酸释放和ATP产生分析的结果加强了这一结果（图3D-F），这表明沉默或抑制c-Myc可以废除NCAPD3在糖酵解调节中的功能。

此外，进行了免疫沉淀和western-blot分析，以探索NCAPD3和c-Myc在细胞核中的潜在相互作用。从数据中发现anti-NCAPD3抗体可以在HCT116细胞中共沉淀c-Myc。此外，在NCAPD3敲低的SW480细胞中，二者的相互作用也得到了支持（图3G, H）。染色质免疫沉淀（ChIP）-PCR检测进一步证实，HCT116细胞中过表达NCAPD3后，GLUT1、HK2、ENO1、PKM2和LDHA基因启动子处c-Myc的结合富集显著增加，而在NCAPD3敲低的SW480细胞中得到的结果相反（图3I, J）。

这些结果表明c-Myc参与了CRC细胞中NCAPD3的糖酵解促进作用。NCAPD3通过增加糖酵解基因GLUT1、HK2、ENO1、PKM2和LDHA的启动子中c-Myc的表达和招募更多的c-Myc来促进Warburg效应。

图3 NCAPD3上调c-Myc并促进其下游代谢基因的表达

4. NCAPD3通过E2F1介导的丙酮酸脱氢酶抑制减弱CRC细胞中TCA循环通量

如图4A和B所示，NCAPD3过表达上调E2F1及其靶基因PDK1和PDK3的水平，进而导致p-PDHE1α（但总PDHE1α）的增加和PDH活性的抑制，而用siRNA或抑制剂或抑制E2F1则逆转了NCAPD3过表达诱导的结果。此外，免疫沉淀实验显示，抗NCAPD3抗体可以在HCT116细胞或NCAPD3敲除的SW480细胞中共沉淀E2F1（图4C, D），这表明NCAPD3和E2F1在CRC细胞中相互作用。在HCT116细胞中，抗E2F1抗体不能共沉淀c-Myc，反之亦然，这表明NCAPD3、c-Myc和E2F1不能形成三聚体复合物（图4E）。在HCT116细胞中，NCAPD3过表达增加了E2F1与PDK1和PDK3基因启动子的结合富集，而在NCAPD3敲低SW480细胞中得到了相反的结果（图4F, G）。

图4 NCAPD3通过调节葡萄糖代谢切换器E2F1抑制TCA循环通量

5. NCAPD3具有促进CRC细胞增殖和转移的作用

NCAPD3过表达促进了HCT116细胞的增殖和克隆形成（图5A, B）。此外，划伤愈合实验数据显示，与对照相比，NCAPD3异位表达显著增加了HCT116细胞的迁移（图5C）。在NCAPD3-敲低的SW480细胞中，细胞的增殖、集落形成和迁移都被大大削弱（图5A-C）。此外，NCAPD3可以通过siRNA敲低（图5D-F）来增强细胞增殖、集散形成和迁移。组织学分析显示，与对照组相比，接受HCT116-NCAPD3亚群的小鼠形成了肺转移灶（图5G）。与对照组相比，过表达NCAPD3导致肺转移瘤中Ki67染色更强（图5H）。这些结果表明，c-Myc和E2F1参与了NCAPD3在体外促进CRC细胞增殖和迁移。此外，体内数据还表明，HCT116细胞中过表达NCAPD3可促进肿瘤肺转移。

图5 NCAPD3促进CRC细胞增殖、迁移和肿瘤转移

6. NCAPD3通过增强CRC细胞有氧糖酵解在小鼠皮下移植瘤模型中促进肿瘤生长

过表达NCAPD3组中移植瘤的大小和重量较对照组明显增大（图6A, B），而2-DG组过表达NCAPD3组移植瘤的大小和重量较过表达NCAPD3组明显减小（图6A，B）。与对照细胞相比，HCT116-NCAPD3细胞形成的异种移植瘤的乳酸水平明显升高，而2-DG处理后的HCT116-NCAPD3细胞形成的肿瘤的乳酸水平较仅HCT116-NCAPD3细胞形成的肿瘤降低（图6C）。NCAPD3过表达对移植瘤中糖酵解相关蛋白水平的影响与乳酸释放实验得出的结论一致（图6D）。

图 6 NCAPD3 增强异种移植肿瘤小鼠模型中的肿瘤生长和有氧糖酵解

与野生型（WT）小鼠相比，NCAPD3小鼠在三次DSS处理中体重下降较少，实验结束时体重增加，结肠长度变长（图7A、B），表明NCAPD3缺陷小鼠对DSS诱导的结肠炎的易感性低于野生型小鼠。此外，NCAPD3小鼠的肿瘤数量和肿瘤大小均显著低于WT同窝小鼠（图7C）。Western blotting数据证实，敲除NCAPD3导致c-Myc、E2F1及其下游靶基因在蛋白水平显著下调，而PDHE1α蛋白总表达量不变（图7D）。组织学上，与NCAPD3±小鼠相比，WT小鼠呈现上皮完整性缺失和几乎完全的隐窝缺失（图7E）。此外，IHC分析还显示，敲除NCAPD3导致c-Myc、E2F1和GLUT1的染色明显减弱（图7E），同样NCAPD3±小鼠的结直肠肿瘤增殖率显著降低，Ki-67细胞核染色比例较低（图7E）。这些体内结果表明，NCAPD3缺乏可通过抑制糖代谢重编程和糖酵解来减轻AOM/DSS诱导的小鼠模型中结直肠肿瘤的发生。

图7敲除NCAPD3可降低AOM/ DSS诱导的小鼠结直肠癌发生

8. CRC患者NCAPD3及其与代谢相关基因的相关性的临床意义

NCAPD3分别与CRC组织中的c-Myc、ENO1、LDHA、E2F1、PDK1和PDK3呈强正相关，这进一步支持了我们的体外和体内实验结果（图8A）。如图8B-D所示，NCAPD3-High/ PKM2-High、NCAPD3-High/LDHA-High和NCAPD3-High/ PDK1-High患者的总生存期较短。最后，使用Western blot方法评估了6对临床CRC组织及其相应的相邻正常组织中NCAPD3、c-Myc和E2F1的表达水平。与相邻正常组织相比，CRC组织中NCAPD3、c-Myc和E2F1的表达量较高（图8E）。这些结果表明NCAPD3及其诱导Warburg效应可能在结直肠肿瘤的发生和结直肠癌的发展过程中发挥重要作用，可能是结直肠癌的潜在标记物和临床治疗靶点。

图8 CRC患者NCAPD3的临床意义及其与代谢相关基因的相关性

结论：

在体内和体外，NCAPD3通过增加c-Myc和E2F1的表达并将这两个转录因子招募到其靶基因的启动子中，从而通过增强糖酵解过程和抑制TCA循环来重编码糖代谢，提示NCAPD3在CRC的发生发展中调节糖代谢起着重要作用。