胶质母细胞瘤抗血管生成治疗的靶点-小胶质细胞外泌体circKIF18A

多形性胶质母细胞瘤（GBM）是最致命的原发性肿瘤。研究GBM血管生成的新分子机制非常重要。研究发现，M2小胶质细胞极化与GBM患者微血管密度呈正相关。M2-胶质瘤相关的小胶质细胞（GAM）可通过将外泌体circKIF18A转运到hBMECs中促进GBM的血管生成。在机制上，circKIF18A可以结合hBMECs中FOXC2，维持其稳定性和核易位。此外，作为一种转录因子，FOXC2可以直接与ITGB3、CXCR4和DLL4的启动子结合并上调其表达。此外，FOXC2还可以激活PI3K/AKT信号，促进GBM的血管生成。我们的研究确定了M2-GAM衍生外泌体circKIF18A通过靶向FOXC2参与GBM血管生成的新分子机制。这可能为改善GBM抗血管生成治疗的疗效提供一个新的治疗靶点。本文于2022年5月发表于Oncogene（IF=8.756）上。

技术路线

结果

1）M2小胶质细胞与GBM患者微血管密度相关

首先，我们分析了TCGA、CGGA、Rembrandt和Gravendel数据库，发现M2极化标记基因（CD163、CD206、ARG1）和血管生成相关基因（CD31、CD34、vWF）之间存在正相关（图1A）。基于TCGA和CGGA数据库的GSEA和GSVA分析表明，CD163高表达组富含血管生成过程和信号传导（图1B、C）。此外，Kaplan-Meier生存分析表明，在TCGA、Rembrandt和Gravendel数据库中，CD163和CD31高表达的患者明显短于CD163和CD31低表达的患者（图1D）。随后，我们采用qPCR、免疫组化等方法检测70例胶质瘤患者中TMEM119、CD163、CD31的表达（图1E）。皮尔逊相关分析显示，CD163或TMEM119与CD31或微血管密度（MVD）之间存在很强的正相关关系（图1F-I）。值得注意的是，CD163和TMEM119高分组的MVD高于低分组（图1J-L）。Kaplan-Meier生存分析还表明，CD163和CD31表达较高的胶质瘤患者的中位生存时间短于CD163和CD31表达较低的胶质瘤患者（图1M）。总之，这些结果表明，M2小胶质细胞与GBM患者微血管密度呈正相关。

2）M2小胶质源性外泌体在体外和体内促进血管生成

我们通过qPCR、western blotting和ELISA分析验证原始HMC3的M2极化，M2标记物（CD163、CD206、ARG1、IL-6和TGF-β）显著上调，M1标记物（IL1β和TNF-α）下调（图2A-C）。我们分离纯化小胶质细胞来源外泌体（MDE），并通过透射电镜（TEM）观察（图2D）。NTA显示，室温下MDE的平均直径为132 nm（图2E）。通过western blotting检测MDE的标记基因（CD9、CD81和TSG101）（图2F）。此外，PKH26分析表明，HUVEC可以吸收MDEs（图2G）。我们进一步检测了M2-MDEs对hBMECs的直接影响。所有EDU、MTS、transwell、迁移和试管形成分析表明，与GW4869治疗组和原始MDEs治疗的组相比，M2- MDEs治疗后hBMECs的生存能力、侵袭、迁移和试管形成能力都有所提高（图2H-M）。总之，这些结果表明M2-MDEs在体外可以促进血管生成。

为了进一步证实M2-MDEs能够促进体内血管生成，我们构建了基于C57BL/6小鼠的同源GBM模型。我们将BV-2 M2或幼稚外泌体注射到GBM荷瘤小鼠体内。结果表明，M2-MDEs治疗后的肿瘤体积增大（图2N，O）。Kaplan-Meier生存分析表明，M2-MDEs治疗可比原始MDEs减少中位生存时间（图2P）。免疫组织化学显示，M2-MDEs治疗可以上调Ki67和CD31的表达以及MVD（图2Q，R）。因此，这些结果表明M2-MDEs在体内可促进GBM的肿瘤发生和血管生成。

3）M2-MDEs将circKIF18A运输到hBMECs中

在HMC3的naïve和M2-MDEs之间进行CircRNA测序。结果显示，有17个差异表达的circRNAs。其中，与幼稚MDEs相比，circKIF18A是M2-MDEs中上调最高的CircRNA（图3A、B、D）。CircKIF18A是从KIF18A mRNA的转录本之一反向拼接而成，由其5-14个外显子组成。Sanger测序证实了头-尾剪接（图3C）。琼脂糖凝胶电泳显示，cDNA中的发散引物扩增了circKIF18A，但gDNA没有扩增（图3E）。此外，RNase R处理显示circKIF18A的表达略有变化，而其线性RNAs KIF18A明显减少（图3F）。FISH分析显示，circKIF18A主要位于M2 HCM3和hBMECs的细胞质中（图3G）。此外，qPCR用于检测MDEs治疗后hBMECs中circKIF18A的表达，结果显示，M2-MDEs治疗后circKIF18A的表达高于幼稚MDEs治疗的hBMECs（图3H）。然后，M2-HMC3中circKIF18A的表达被敲低或过表达，并通过qPCR进行验证（图3I）。同样，在circKIF18A-KD M2-MDEs治疗后，qPCR也显示circKIF18A-KD M2-MDEs（图3J）和hBMECs（图3K）中circKIF18A表达下调。然而，circKIF18A-OE M2-MDEs治疗后的结果相反（图3J，K）。总之，这些结果表明circKIF18A在M2-MDEs中过表达，并可通过MDEs转运到内皮细胞中。MTS、EDU、transwell、迁移和试管形成分析表明，与阴性对照（NC）M2-MDEs相比，circKIF18A-KD M2-MDEs处理后，hBMECs的细胞活力、增殖、侵袭、迁移、分支数量和小管长度均减少（图3L-P），提示M2小胶质细胞外泌体circKIF18A在体外可促进血管生成。

4）M2小胶质细胞外泌体circKIF18A可直接与FOXC2结合

由于M2极化与GBM患者微血管密度相关，我们基于CD163在TCGA和CGGA数据库中的表达进行了GSEA。我们收集了至少在两条血管生成途径中起作用的基因，发现了6个重叠基因，包括PTGS2、FLT4、SULF1、FOXC2、NRP1和VEGFA（图4A，B）。我们进一步探讨了circKIF18A与hBMECs中这些基因之间可能的分子机制。qPCR显示，在hBMECs中，经circKIF18A-KD或circKIF18A- OE M2-MDEs治疗后，这六个基因的mRNA表达没有持续变化（图4C）。然而，WB显示，在circKIF18A-KD M2-MDEs处理后，VEGFA和FOXC2表达下调，而在circKIF18A-OE M2-MDEs处理后，PTGS2、NRP1、FOXC2的蛋白表达上调（图4D）。因此，FOXC2可能是受circKIF18A调控的候选基因。根据catRAPID数据库的预测，circKIF18A可以与FOXC2蛋白结合，尤其是circKIF18A的Δ291–350区域与FOXC2蛋白的Δ376–427区域之间的相互作用位点（图4E）。RIP分析显示，抗FOXC2组中circKIF18A的相对富集度明显高于IgG治疗组。此外，在circKIF18A-OE M2-MDEs处理后，circKIF18A的富集程度更高，而在circKIF18A-KD M2-MDEs处理后，circKIF18A的富集程度降低（图4F）。RNA下拉分析还表明，生物素化的circKIF18A wt探针可以下拉hBMEsC中的FOXC2，而circKIF18A mt探针不能（图4G）。此外，将FOXC2 DNA片段克隆到pCMV5质粒中并转染到hBMECs中。RIP分析进一步显示，在pCMV5-Δ376–427组中，circKIF18A的富集程度更高（图4H）。这些结果表明，circKIF18A可以直接与FOXC2蛋白结合。MG-132处理hBMECs后，由circKIF18A-KD M2-MDE引起的FOXC2蛋白表达减少得到恢复（图4I）。CHX分析表明，在hBMECs中，经circKIF18A-KD M2-MDEs处理后，FOXC2蛋白的半衰期缩短，经circKIF18A-OE M2-MDEs处理后，FOXC2蛋白的半衰期延长（图4K，L）。此外，在hBMECs中，经circKIF18A-KD M2-MDEs处理后，FOXC2主要存在于细胞质中，几乎没有核分布，而经circKIF18A-OE M2-MDEs处理后，其核分布明显增加（图4M）。CircKIF18A-KD M2-MDEs处理下调了细胞核中FOXC2的表达，而CircKIF18A- OE M2-MDEs处理上调了细胞核中FOXC2的表达（图4J）。因此，这些结果表明M2-HMC3通过外泌体circKIF18A诱导FOXC2稳定性和核易位。

5）M2小胶质细胞外泌体circKIF18A通过FOXC2促进体外血管生成

为了进一步证实M2小胶质细胞外泌体circKIF18A通过靶向FOXC2促进血管生成，hBMECs中FOXC2的表达被基于慢病毒的RNAi沉默，并且qPCR和WB验证了这些效应（图5A，B）。尽管使用circKIF18A-OE M2-MDEs处理，MTS、EDU、transwell、migration和tube formation实验显示FOXC2敲除后，与阴性对照组相比，EDU阳性hBMECs的比率、hBMECs的侵袭和迁移数量、hBMECs的分支数量和小管长度均下降（图5C–G）。因此，这些结果表明，M2小胶质细胞外泌体circKIF18A在体外通过FOXC2促进血管生成。

6）M2小胶质外泌体circKIF18A可促进FOXC2对ITGB3、CXCR4、DLL4和PI3K/AKT信号通路的转录调控能力

我们根据Jaspar数据库的预测进一步进行了荧光素酶报告分析和芯片分析（图6A-D）。结果表明，在circKIF18A-KD M2-MDEs治疗后，pGL3-ITGB3-wt、pGL3-CXCR4-wt和pGL3-DLL4-wt的相对荧光素酶活性均下调，而在circKIF18A-OE M2-MDEs治疗后，其相对荧光素酶活性增强（图6E–J）。芯片分析还表明，在使用circKIF18A-KD M2-MDEs处理后，抗FOXC2可降低hBMECs中ITGB3、CXCR4和DLL4的富集度（图6K），而在使用circKIF18A-OE M2-MDEs处理后获得相反的结果（图6L）。此外，qPCR和WB也证实了circKIF18A-KD或circKIF18A-OE M2-MDEs处理后ITGB3、CXCR4和DLL4的表达水平（图6M-P）。据报道，FOXC2可以通过激活PI3K/AKT信号促进肿瘤的恶性表型。用WB检测PI3K/AKT信号的活性。结果表明，在hBMECs中，经circKIF18A-KD MDEs治疗后，p-PI3K、p-AKT和p-MTOR的表达均下调（图6Q），而经circKIF18A-OE MDEs治疗后，结果相反（图6R）。

7）M2小胶质细胞外泌体circKIF18A促进体内肿瘤生长和血管生成

Mmu_U circ_0009168是小鼠体内circKIF18A的同源circRNA。其在BV-2中的过表达和敲除通过qPCR进行验证（图3E）。然后将mmu_circ_0009168-KD或mmu_circ_0009168-OE M2-MDEs注射到C57BL/6小鼠的同源GBM模型中。结果表明，与NC M2-MDEs相比，mmu_circ_0009168-OE M2-MDEs治疗后肿瘤体积明显增大（图7A，B）。Kaplan-Meier生存分析表明，mmu_circ_0009168-OE M2-MDEs比NC M2-MDEs能缩短中位生存时间（图7C）。免疫组织化学显示，mmu_circ_0009168-OE M2-MDEs治疗后，Ki-67、CD31和MVD的表达增加（图7D，H）。然而，mmu_circ_0009168-KD M2-MDEs治疗后的结果相反（图7D-H）。这些结果表明，M2小胶质细胞外泌体circKIF18A在体内促进肿瘤的生长和血管生成。为了说明我们的发现，图7I中的示意图显示，胶质母细胞瘤相关的小胶质细胞来源的外泌体circKIF18A通过靶向FOXC2促进血管生成。

结论：M2小胶质细胞通过运输外泌体circKIF18A进入 hBMECs，促进GBM血管生成。从机制上讲，circKIF18A可以结合hBMECs中FOXC2，维持其稳定性和核转位。FOXC2可以通过转录调控ITGB3、CXCR4、DLL4的表达，激活PI3K/AKT信号通路。我们的研究为GBM的抗血管生成治疗提供了新的机制和靶点，这可能会改善抗血管生成治疗的效果。

参考文献：

Jiang Y, Zhao J, Xu J, Zhang H, Zhou J, Li H, Zhang G, Xu K, Jing Z. Glioblastoma-associated microglia-derived exosomal circKIF18A promotes angiogenesis by targeting FOXC2. Oncogene. 2022;41(26):3461-3473. doi: 10.1038/s41388-022-02360-4.