PCBP1抑制铁自噬介导的铁死亡

细胞质中铁离子分子伴侣PCBP1是一个多功能的RNA结合蛋白，参与基因的转录，RNA的调控，和铁离子加载至铁蛋白的过程。PCBP1也是众所周知的自噬抑制分子，但是PCBP1在铁自噬和铁死亡中的作用尚未可知。因此，本研究旨在探究PCBP在铁自噬介导的铁死亡在头颈癌中的作用。本研究于2022年5月发表在《Redox Biology》IF：11.799期刊上。

技术路线：

主要研究结果

1、PCBP1的表达和HNC的存活及铁死亡敏感性有关

作者通过TCGA分析发现PCBP1的表达在正常和HNC肿瘤组织中无差异，但是低表达PCBP1的患者总体生存率显著更高。此外，PCBP1低表达的细胞对erastin的敏感性更高，表现为在同浓度erastin处理下，PCBP1低表达的细胞比PCBP1高表达细胞的活力更低、死亡更多、经历脂质过氧化的细胞比例更高、LIP更高（附图1C-1I）。但是这些作用可以被ferrostatin-1或deferoxamine减缓（附图1J）。这些结果表明PCBP1表达和HNC的存活及铁死亡敏感性有关。

附图1 PCBP1的表达和HNC的存活及铁死亡敏感性有关

2、敲除PCBP1增加HNC细胞对铁死亡的敏感性

随后作者通过PCBP1的功能丢失实验验证PCBP1与HNC细胞对铁死亡敏感性的关系。在PCBP1高表达的HN3，HN6，HN12的细胞中敲除PCBP1，结果发现细胞内总铁和亚铁含量、LIP、ROS和细胞死亡均显著增加，但重新表达PCBP1可以减轻上述影响（图1A-1J）。随着PCBP1的敲除，铁稳态相关分子表达水平发生变化，FTH1和FPN表达下调，而DMT1和TFRC表达上调（图1K-1L）。这些结果表明PCBP1敲除通过细胞内亚铁积累促进细胞对铁死亡诱导剂的敏感性。

图1敲低PCBP1增加HNC细胞对铁死亡的敏感性

3、PCBP1负调控BECN1 mRNA

PCBP1作为RNA调节因子在翻译过程中起着重要作用。作者通过RBP图谱分析了BECN1 mRNA的序列，以确定PCBP1的结合区域，结果显示预测的PCBP1的结合区域位于BECN1 mRNA的3’UTR区域（图2A）。用于荧光素酶检测的BECN1 mRNA片段就是从这一发现中产生的（图2B-2C）。随着pcDNA 3.1-PCBP1的引入，pLFL(全长片段)和pLF2(包括PCBP1结合区)的荧光素酶活性降低（图2D）。pull-down验证了PCBP1和BECN1的结合（图2E）。以上提示PCBP1负调控BECN1 mRNA。

图2 PCBP1使BECN1 mRNA失去稳定性

4、敲除PCBP1增强了铁自噬诱导性

使用erastin处理的情况下，与对照组比较，PCBP1敲除的细胞中自噬斑点（及与亚铁共染斑点）数量增加、细胞活力下降、细胞内亚铁含量增加（图3A-3C）；此外，PCBP1敲除细胞中LC3B-II、Atg5和4-HNE表达增加，而p62、NCOA4和铁蛋白表达减少，然而，使用巴菲霉素A1处理细胞后，LC3B-II和p62表达增加（图3D）。PCBP1基因的敲除可显著增加细胞中亚铁含量和共染色点状体的数量（图3E-3F）。这些结果表明PCBP1阻碍了铁自噬体的铁离子释放。

图3 敲除PCBP1增强了铁自噬诱导性

作者此前的研究发现铁离子过载进入线粒体后会导致线粒体功能异常。此外，PCBP1敲除后，TMRE显著下降，线粒体超氧化物和亚铁染色强度显著增加（附图5）。这些研究表明PCBP敲除导致线粒体功能异常是通过增加铁离子过载进入线粒体。

附图5 铁自噬引起的铁离子过载导致线粒体功能异常。

5、PCBP1负调控脂质过氧化

PCBP1还可以特异性调控ALOX15的3’端翻译，ALOX15是氧化生成PUFA的关键分子。因此，作者接下来探究敲除PCBP1是否会导致氧化PUFA的增加。结果显示，敲除PCBP1增加了细胞内脂质、氧化PUFA、游离脂肪酸水平、相关分子的表达、MDA和4-HNE水平（附图6）。当细胞暴露于erastin或sulfasalazine时，与油酸(10 μM)相比，亚油酸(10 μM)作用时细胞活力显著降低（附图6F）。在PCBP1敲低的细胞中，FASN、FADS2、SCD1和SREBP1增加，在PCBP1过表达的细胞中减少（附图6H）。这些结果表明，敲除PCBP1通过激活脂肪酸合成和ALOX15表达，促进了PUFA的生成和脂质过氧化。

附图6 PCBP1负调控脂质过氧化

6、PCBP1敲除增加了肿瘤的铁死亡易感性

最后，作者在体内检测敲除PCBP1是否会增加铁死亡易感性。PCBP1-抑制组(HN12 shPCBP1)和PCBP1-过表达组(HN2 PCBP1质粒)的肿瘤生长速度均高于载体对照组（图4A-4C）。此外，施用sulfasalazine显著抑制肿瘤生长：在HN12 shPCBP1中更显著。细胞内铁离子含量，脂质含量和脂质过氧化积累在HN12 shPCBP1肿瘤中更高，并且sulfasalazine处理后更高（图4D-4F）。在PCBP1抑制或低表达组中，经sulfasalazine处理后ACSL4、ALOX15、4-HNE和PTGS2的表达增加，而FTH1和NCOA4的表达降低，但在PCBP1过表达组则相反（图4G）。因此，PCBP1敲除有助于体内铁死亡敏感性的增加。

图4 PCBP1敲除增加了肿瘤的铁死亡易感性

参考文献

Lee Jaewang., You Ji Hyeon., Roh Jong-Lyel.(2022). Poly(rC)-binding protein 1 represses ferritinophagy-mediated ferroptosis in head and neck cancer. Redox Biol, 51(undefined), 102276. doi:10.1016/j.redox.2022.102276